一種兒茶酚-o-甲基轉(zhuǎn)移酶酶活力檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，同時又屬于臨床診斷和檢測領(lǐng)域。具體而言，本發(fā) 明提供了 一種測定兒茶酪-〇-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT，Cat echo l-0-me thy 1 transferase，EC 2.1.1.6)酶活力的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 兒茶酪-〇-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT，(^itechol-〇-methyltransferase，EC 2.1.1.6)，是 一種重要的代謝酶，廣泛存在于哺乳動物組織和紅細胞中，它存在膜結(jié)合型（membrane- bound COMT，MB-C0MT)和可溶型（soluble COMT，S-C0MT)兩種形式。人體內(nèi)的COMT的甲基化 反應(yīng)作用底物是多種兒茶酪類化合物，如腎上腺素、去甲腎上腺素和多己胺(DA)等。在中樞 神經(jīng)系統(tǒng)中，COMT作為代謝酶將兒茶酪結(jié)構(gòu)的神經(jīng)遞質(zhì)去活；同時對兒茶酪雌激素，兒茶酪 藥物W及某些致癌物質(zhì)也起到代謝作用。
[0003] COMT是體內(nèi)兒茶酪類化合物的代謝的重要酶，Vall08/158Met的替換導(dǎo)致COMT酶 活力存在多樣性，其酶活力強弱與體內(nèi)兒茶酪類化合物的含量有密切關(guān)系，在突觸間隙特 別是突觸后膜上COMT的活性較高，可將S-腺巧蛋氨酸提供的甲基轉(zhuǎn)移到兒茶酪胺苯環(huán)的3 位氧上，成為3-甲氧基4-徑基衍生物，是具生物活性或毒性的兒茶酪胺的主要代謝酶，也是 中樞神經(jīng)系統(tǒng)外多己胺的主要降解酶，該酶的功能與精神分裂癥、帕金森病、抑郁癥、兒童 孤獨癥、焦慮癥、屯、境障礙、強迫癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有重要的關(guān)系。
[0004] 兒茶酪-0-甲基轉(zhuǎn)移酶功能改變將直接引起體內(nèi)多己胺及其他兒茶酪胺類物質(zhì)含 量的變化，兒茶酪胺特別是多己胺系統(tǒng)是精神分裂癥發(fā)病機制中最引人關(guān)注的生物學(xué)因 素。目前已知COMT的Vall08/158Met功能多態(tài)性影響精神分裂癥的發(fā)生、臨床特征、認知功 能及治療反應(yīng)，攜帶低活性COMT基因型者對傳統(tǒng)抗精神病藥物的反應(yīng)較差。COMT的活性測 定是研究帕金森病發(fā)病機制和治療藥物研發(fā)的重要依據(jù)，可W應(yīng)用COMT的抑制劑治療中晚 期的帕金森病，如恩他卡朋，該抑制劑可W使血漿左旋多己的濃度平穩(wěn)，并使左旋多己的劑 量減少，同時異動癥的發(fā)生也相應(yīng)減少。
[0005] 單雙相抑郁癥患者紅細胞COMT平均活性濃度要低于正常人水平，運也間接證明了 抑郁癥的發(fā)病機制與血漿紅細胞中的COMT活性濃度降低有關(guān)。也有報道說明男女患者呈現(xiàn) 不同的COMT水平，但均異于正常人水平，對于COMT活性濃度水平的研究對研究或診斷治療 抑郁癥有很重要的意義。
[0006] COMT酶活性存在個體差異，其表型是由C0MTH(高活性)和C0MTL(低活性)兩個等位 基因決定的，COMT在大腦皮層前額葉神經(jīng)元突觸后兒茶酪胺的代謝活動中起著特別重要的 作用，大腦皮層額葉功能的改變，與孤獨癥的核屯、癥狀之一的認知缺陷相吻合。有研究發(fā)現(xiàn) 孤獨癥患者COMT基因的高活性基因型（G/G)的頻率顯著高于父母對照組，所W對于研究 COMT基因型與孤獨癥發(fā)病的關(guān)聯(lián)性還是非常有必要的。
[0007] 有研究表明焦慮癥的發(fā)病與多己胺系統(tǒng)的功能異常有關(guān)，對COMT基因的研究對掲 示焦慮癥的發(fā)病原因有重要的意義。有研究表明女性患者COMT等位基因與基因型分布均與 對照有顯著差異，但男性患者并無顯著差異，表明COMT基因型與女性焦慮癥患者的相關(guān)人 格特征一高避害化arm avoidance，HA)可能存在一定的相關(guān)性。
[000引雌激素代謝產(chǎn)物兒茶酪雌激素 （catechol estrogen，CE)可直接引起機體DNA的損 傷和突變，從而誘發(fā)癌癥。在肝外組織中，雌激素的代謝是通過C0MT完成的。CE在C0MT的作 用下形成可溶于水的代謝產(chǎn)物排出體外，減少由于CE堆積對組織局部產(chǎn)生的刺激作用。如 果C0MT含量不足或活性降低，CE即可被細胞色素 P450(巧tochrome P450，CYP450)酶催化形 成相應(yīng)的釀類化合物，與DNA結(jié)合發(fā)生脫嚷嶺反應(yīng)形成脫嚷嶺化合物，運種脫嚷嶺作用可促 使機體DNA損傷和突變，進一步引起腫瘤發(fā)生。
[0009] 有研究報道通過對子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜增生及正常子宮內(nèi)膜的研究發(fā)現(xiàn)，攜帶 COMTVal/Val基因型的婦女相對于COMTMet/Met基因型者發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險可能會降 低，C0MT基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風(fēng)險由關(guān)，且子宮內(nèi)膜癌組織中S-C0MT和MB-C0MT 蛋白的表達水平明顯低于對照組，但對外周血S-C0MT活性的研究顯示并無明顯差異，有可 能子宮內(nèi)膜癌患者體內(nèi)的COM巧舌性變化體現(xiàn)在子宮內(nèi)膜病變局部的活性降低。另外在乳腺 癌的研究中發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中C0MT的活性要低于對照組，運對診斷W及治療子宮內(nèi)膜癌 及乳腺癌都有顯著的意義。
[0010] 目前C0MT酶活力檢測的方法主要有W下幾種，主要檢測方法是用HPLC的方法進行 檢測，其原理是W3,4-二徑基苯甲酸(DBA)為底物，S-腺巧甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，在儀 離子的存在下，將SAM上得的甲基轉(zhuǎn)移至DBA的3位氧上，生成產(chǎn)物4-徑基-3-甲氧基苯甲酸 (4-OH-3-MBA)，采用HPLC對該反應(yīng)的生成物進行定量測定。另一種是放射化學(xué)法。放射化學(xué) 法測定C0MT活性的是m4C標記的S-甲基14C-腺巧-甲硫氨酸（14-SAM)為標記甲基的供者。 還有是采用氣相色譜法檢測。綜合上述幾種檢測方法來看，放射法的前期處理較復(fù)雜，對技 術(shù)要求較高且易造成污染，而氣相色譜法和HPLC法對設(shè)備要求較高，操作相對復(fù)雜，檢測周 期也較長;上述兩種方法的特點均不利于推廣使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 因此，基于上述已有技術(shù)的缺陷，為了解決現(xiàn)有兒茶酪-0-甲基轉(zhuǎn)移酶（C0MT， Catechol-〇-methyltransferase，EC 2.1.1.6)的酶活力檢測方法不易推廣的問題，本發(fā)明 的目的是提供一種快速、特異、準確可靠的C0MT酶活力檢測方法。采用該方法可W在半自動 或全自動的分析檢測設(shè)備上使用，而且檢測靈敏度高，特異性高，操作簡便，因而可W得到 切實的推廣使用。
[0012] 針對上述發(fā)明目的，本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0013] 本發(fā)明提供一種兒茶酪-0-甲基轉(zhuǎn)移酶(C0MT)酶活力檢測方法，所述方法包括： (1)將含C0MT的樣本與S-腺巧-1^-甲硫氨酸（SAM)和甲基受體接觸W形成S-腺巧-k同型半 脫氨酸(SAH)和甲基受體的甲基化產(chǎn)物，（2)通過將所述SAH與S-腺巧同型半脫氨酸水解 酶（SA化se)相接觸W生成高半脫氨酸化cy)和腺巧(Ado),采用光度計評估所述Ado的產(chǎn)生 速率W檢測所述樣本中所述C0MT的酶活力。
[0014] 優(yōu)選地，根據(jù)前述的兒茶酪-0-甲基轉(zhuǎn)移酶酶活力檢測方法，其中，所述甲基受體 為兒茶酪類化合物。優(yōu)選地，所述兒茶酪類化合物為兒茶酪胺苯甲酸。最優(yōu)選為3，4-二徑基 苯甲酸(DBA)。
[0015] 更優(yōu)選地，根據(jù)前述的COMT酶活力檢測方法，其中，所述方法包括：
[0016] (1)所述含C0MT的樣本、所述SAM和所述甲基受體混合并反應(yīng)獲得反應(yīng)液1;
[0017] (2)將所述S-腺巧-心同型半脫氨酸水解酶加入步驟（1)中的所述反應(yīng)液1中并反 應(yīng)，獲得反應(yīng)液2;
[0018] (3)將步驟(2)中所述的反應(yīng)液2離屯、獲得上清液；
[0019] (4)采用光度計檢測步驟(3)中所述的上清液的光吸收值，間接或直接地評估所述 Ado的產(chǎn)生速率W檢測所述樣本中所述兒茶酪-0-甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活力。
[0020] 再優(yōu)選地，根據(jù)前述的C0MT酶活力檢測方法，其中，所述方法包括:在步驟(1)過程 和步驟(2)過程中加入緩沖液;優(yōu)選地，所述緩沖液選自甘氨酸/氨氧化鋼、巧樣酸/巧樣酸 鋼、憐酸氨鹽/削i酸(鹽）、憐酸鹽、2-嗎嘟代乙橫酸緩沖液、3-嗎嘟丙橫酸緩沖液、4-徑乙 基贓嗦乙橫酸緩沖液、Tris-鹽酸、棚酸-棚砂、己比妥鋼-鹽酸緩沖液中的一種或多種。最優(yōu) 選為Tris-鹽酸。
[0021] 還優(yōu)選地，根據(jù)前述的C0MT酶活力檢測方法，其中，所述緩沖液為10~lOOOmmol/ L，優(yōu)選為25~lOOmmol/L，最優(yōu)選為30mmol/L。所述甲基受體為0.002~lOmmol/L，優(yōu)選為 0.05~0.5mmol/L，最優(yōu)選為0.4mmol/L。所述S-腺巧-k甲硫氨酸為0.02~2mmol/L，優(yōu)選為 0.05~0.5mmol/L，最優(yōu)選為0.2mmol/L。及所述S-腺巧-1^-同型半脫氨酸水解酶為0.01~ 100KU/L，優(yōu)選為0.1 ~50KU/L;最優(yōu)選為 10KU/L。
[0022] 或還優(yōu)選地，根據(jù)前述的C0MT酶活力檢測方法，其中，步驟（1)中所述反應(yīng)的條件 為置于35°C環(huán)境中溫浴60min。優(yōu)選地，步驟(2)中所述反應(yīng)的條件為置于30°C環(huán)境中溫浴 1 Omin。更優(yōu)選地，步驟(3)中所述離屯、為10, OOOg離屯、10分鐘。
[0023] 或還優(yōu)選地，根據(jù)前述的C0MT酶活力檢測方法，其中，所述方法還包括在步驟（1) 前將所述含C0MT的樣本進行前期處理，所述前期處理為所述含C0MT的樣本與試劑混合，所 述試劑為油酸、膽酸鹽、Tween 20、化ij35或牛橫膽酸鋼。優(yōu)選地，所述試劑在上述混合后， 達到的體積百分濃度為0.05-1 %。最優(yōu)選為0.5%。
[0024] 進一步優(yōu)選地，根據(jù)前述的C0MT酶活力檢測方法，其中，所述方法還包括，在所述 前期處理后，將所述含C0MT的樣本在冰上放置30min。
[0025] 優(yōu)選地，根據(jù)前述的COMT酶活力檢測方法，其中，所述SAM由Ξ憐酸腺巧，甲硫氨酸 和S-腺巧甲硫氨酸合成酶化C 2.5.1.6)組成的酶反應(yīng)系統(tǒng)所生成。
[00%]優(yōu)選地，根據(jù)前述的C0MT酶活力檢測方法，其中，所述含C0MT的樣本選自生物組 織、體液和細胞中的一種或多種;優(yōu)選地，所述生物組織選自肺、膜腺、小腸、腎、胎盤、骨骼 肌、乳腺、腦和肝臟中的一種或多種，所述體液為血液，所述細胞為紅細胞。
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