一種粘附斑激酶抑制劑多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及粘附斑激酶抑制劑多肽及其應(yīng)用，具體涉及具有抑制粘附斑激酶活性、治療急性淋巴細(xì)胞性白血病的多肽。
【背景技術(shù)】
[0002]急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)是一種進(jìn)行性惡性疾病，其特征為大量的類似于淋巴母細(xì)胞的未成熟白細(xì)胞。這些細(xì)胞可在血液、骨髓、淋巴結(jié)、脾臟和其它器官中發(fā)現(xiàn)。急性淋巴細(xì)胞性白血病占兒童急性白血病的80%，發(fā)病率高峰在3歲至7歲之間。ALL也可發(fā)生于成年人，占所有成年人白血病的20%。近年來隨著醫(yī)學(xué)研究的深入，對(duì)急性淋巴細(xì)胞性白血病的認(rèn)識(shí)和治療取得了很大進(jìn)展。其中，粘附斑激酶在急性淋巴細(xì)胞性白血病中扮演著重要角色。
[0003]粘附斑激酶(focal adhes1n kinase，F(xiàn)AK )是一種胞質(zhì)非受體蛋白酪氨酸激酶，是粘附斑復(fù)合物家族(focal adhes1n complex family)的一員。具有酪氨酸激酶活性，在受到原癌基因產(chǎn)物和胞外基質(zhì)-整合素的刺激后發(fā)生磷酸化。此外，小神經(jīng)肽、內(nèi)皮素和血管升壓素等都能使其磷酸化FAK參與了多條細(xì)胞信號(hào)通路，它是胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中樞。它可以整合來自胞外的營養(yǎng)、壓力、細(xì)胞粘著等方面的信號(hào)，調(diào)節(jié)下游分子的活性，控制細(xì)胞的代謝、增殖，甚至是細(xì)胞的命運(yùn)。近年的研究表明FAK可以調(diào)控細(xì)胞的生長、錨定、迀移、惡變和凋亡等過程，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。
[0004]目前發(fā)現(xiàn)有FAK表達(dá)或者活性增強(qiáng)的腫瘤有結(jié)腸癌、乳腺癌、胸腺癌、胃癌以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和黑色素瘤等。用FAK特異性抑制劑處理體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，可以抑制細(xì)胞的增殖、生長、擴(kuò)散和迀移。磷酸化的FAK與Src形成復(fù)合體，可以激活或抑制多條下游通路，包括PI3K /Akt、RIP、p53和RAS-Erk等，起始腫瘤發(fā)生或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Wu等用shRNA技術(shù)處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK可以抑制整合素A5B1誘導(dǎo)的細(xì)胞迀移，并且FAK還可以通過其激酶結(jié)構(gòu)域活化Src。當(dāng)小鼠乳腺缺失了FAK后，不影響乳腺上皮細(xì)胞的正常發(fā)育，但卻能抑制由PyMT激發(fā)的乳腺癌的發(fā)生；敲出體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞的FAK，可以阻止癌細(xì)胞的生長、誘導(dǎo)細(xì)胞衰老(cell senescent)。用ATP競爭性FAK和PYK2抑制劑，如PF-562，27UPF-573，228等，處理體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，可以抑制細(xì)胞迀移。一期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)AK抑制劑對(duì)多種腫瘤有明顯的治療作用。FAK是腫瘤發(fā)生、增殖、迀移等過程的關(guān)鍵蛋白，研究新的特異性FAK抑制劑將是癌癥研究和治療的途徑之一。但目前未見有FAK抑制劑治療急性淋巴細(xì)胞性白血病。
[0005]因此，需要設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)的粘附斑激酶抑制劑用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病。粘附斑激酶抑制劑包括大分子和小分子。大分子抑制劑的制備和使用限制了它們的發(fā)展，例如重組人粘附斑激酶抑制因子的體內(nèi)半衰期短。很多成功的小分子抑制劑，可以在納摩爾水平上抑制粘附斑激酶的活力，但小分子抑制劑缺乏特異性，如果在慢性疾病中長期使用缺乏特異性的粘附斑激酶抑制劑可產(chǎn)生較大副作用。因而，從粘附斑激酶抑制劑的應(yīng)用角度來看，以急性淋巴細(xì)胞白血病作為研究對(duì)象是正確的選擇。在急性反應(yīng)期，機(jī)體能夠耐受短期的、粘附斑激酶廣譜抑制劑對(duì)正常生理功能的抑制，同時(shí)使關(guān)鍵組織器官的生理結(jié)構(gòu)免受破壞，增加了生存幾率。
[0006]本專利中的粘附斑激酶抑制劑多肽I已證明在急性淋巴細(xì)胞白血病中有效，具有在其他腫瘤模型中開發(fā)的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]發(fā)明目的
本發(fā)明提供全新的序列，該序列粘附斑激酶抑制劑，對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病具有很好的療效。
[0008]技術(shù)方案
粘附斑激酶抑制劑多肽，其特征在于其序列為DLIDGYRLVNGYSQRALERRGD。
[0009]粘附斑激酶抑制劑多肽在制備治療急性淋巴細(xì)胞白血病藥物中的應(yīng)用。
[0010]有益效果
利用固相合成法化學(xué)合成粘附斑激酶抑制劑多肽I，該多肽具有全新的序列，該多肽可體外抑制粘附斑激酶，治療急性淋巴細(xì)胞白血病。在內(nèi)毒素休克模型實(shí)驗(yàn)中成功的增加了小鼠的生存率。我們發(fā)現(xiàn)的多肽抑制劑可以同時(shí)抑制粘附斑激酶活力，并在體內(nèi)試驗(yàn)中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發(fā)價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1
粘附斑激酶抑制劑多肽I對(duì)體外粘附斑激酶活性的作用。
[0012]取新鮮牛腦組織，剝?nèi)ツX膜和大的血管，剪碎，用冷MES緩沖液洗滌1-2次，以每克腦組織0.5-lml的比例加入MES緩沖液，在4 °C下，用電動(dòng)勻漿器勻漿；4 °C，105000g離心lh，取上清，加入等體積的微管聚合緩沖液，37°C水浴保溫301^11。26°(:，105000g離心Ih，取沉淀，加入約1/10勻漿體積的冷MES緩沖液，輕輕攪拌或用勻漿器將沉淀碾碎;將懸液放冰浴30min，使沉淀完全溶解。用Lowry’s法測定蛋白含量(SDS聚酰胺凝膠電泳法)。粘附斑激酶用MES緩沖液稀釋至4-5mg/ml，置液氮中保存。取冷凍的粘附斑激酶溶液，快速用常溫水沖其壁，使之融化，放入冰浴，用MES緩沖液稀釋至所需濃度(2-3mg/ml)，加入ATP至lmmol/1。以從冰浴中馬上取出的粘附斑激酶溶液在分光光度計(jì)350nm處調(diào)定為“O”點(diǎn)。然后將比色杯在37°C溫度下測定粘附斑激酶溶液的OD值，連續(xù)20-30min，記錄溫度-吸光值曲線(T-OD曲線)，重復(fù)三次。
[0013]抑制率計(jì)算:抑制率(％)=(對(duì)照管“0D”值一加藥管“0D”值)/對(duì)照管“0D”
實(shí)驗(yàn)組設(shè)五個(gè)劑量:0.75μΜ、1.5μΜ、3μΜ、12μΜ、24μΜ，陽性對(duì)照組長春新堿劑量4μΜ，空白組加入等體積的溶劑DMS0;按上述操作測定吸光值。結(jié)果，隨粘附斑激酶抑制劑多肽I濃度增加，抑制率逐漸升高，說明有抑制粘附斑激酶活性隨藥物濃度的增加而不斷增加。
[0014]實(shí)施例2
粘附斑激酶抑制劑多肽I對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生長和存活I(lǐng)C50。
[0015]采用MTT比色法。將對(duì)數(shù)生長的U937細(xì)胞，以1.0 X 105加入96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)孔、陽性藥物對(duì)照孔分別加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物粘附斑激酶抑制劑多肽I和陽性對(duì)照藥物長春新堿;空白組加入相同體積的溶劑。每孔設(shè)五個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h，分別在0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h 每孔加入MTT，作用4h后，加入 DMSO，孵育 30min，在酶標(biāo)儀620nm處測定吸光度A值，按公式腫瘤細(xì)胞生長抑制率=(1_實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值)X 100%。計(jì)算出實(shí)驗(yàn)藥物的IC50為23.43μΜ。
[0016]實(shí)施例3
用腫瘤模型檢測粘附斑激酶抑制劑多肽I的體內(nèi)活力。
[0017]建立U937腫瘤模型，陽性對(duì)照藥物長春新堿;空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)劑量:0.75、1.5μΜ、3μΜ mg/Kg。21天后，觀察小鼠存活數(shù)量，計(jì)算存活率。結(jié)果顯示，粘附斑激酶抑制劑多肽I可有效地保護(hù)小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，生存率達(dá)到91.31%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.粘附斑激酶抑制劑多肽，其特征在于其序列為DLIDGYRLVNGYSQRALERRGD。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粘附斑激酶抑制劑多肽在制備治療急性淋巴細(xì)胞性白血病藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及具有抑制粘附斑激酶活性，治療急性淋巴細(xì)胞性白血病的多肽。其序列為DLIDGYRLVNGYSQRALERRGD是全新的序列，它們可以體外抑制粘附斑激酶活性，并在體內(nèi)試驗(yàn)中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發(fā)價(jià)值。
【IPC分類】A61K38/16, C07K14/00, A61P35/02
【公開號(hào)】CN105585618
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610063186
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請(qǐng)人】蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司
【公開日】2016年5月18日
【申請(qǐng)日】2016年1月30日