一種植物乳桿菌jm113及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種植物乳桿菌JM113及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著抗生素在畜牧生產(chǎn)中大量使用所帶來的種種弊端的日益凸顯，如導(dǎo)致動物腸 道正常菌群失調(diào)，動物整體免疫低下，產(chǎn)生耐藥性細(xì)菌甚至發(fā)生抗生素在畜禽產(chǎn)品中的殘 留，開發(fā)替代抗生素的新型環(huán)保安全高效的綠色飼料添加劑已成為必然趨勢。
[0003] 近年來，益生菌替代抗生素來促生長、預(yù)防和治療炎癥性腸病成為研究的熱點(diǎn)，益 生菌因其益生特性在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用前景非常廣闊，但不是所有菌株都可W作為益生菌， 可作為益生菌的菌株應(yīng)具有W下特征：（1)正確的益生菌菌株來源；已有研究表明，理想的 益生菌菌株最好來自本源動物；（2)對動物健康無負(fù)面影響，很多細(xì)菌在代謝過程中會產(chǎn)生 毒素或類毒素等，而運(yùn)些有毒的物質(zhì)會影響動物的健康，因此安全性是決定一株菌能否成 為益生菌的必要條件；（3)對胃腸道酸、膽鹽等抑制因素有較強(qiáng)的耐受性，因?yàn)橐嫔氖?用方式多為口服，先到達(dá)胃再安全到達(dá)腸道才能發(fā)揮作用，所W益生菌首先必須具有較強(qiáng) 的耐酸、耐膽鹽和耐膜蛋白酶的特性，保證到達(dá)后腸道前不被抑制或殺死，才能發(fā)揮有益作 用；（4)具有良好的抑菌活性，可抑制腸道中常見病原微生物的生長和繁殖；（5)能用于生產(chǎn) 加工并保持較強(qiáng)活力，性能較好的益生菌不僅在經(jīng)過飼料添加劑的各種加工程序之后仍具 有較好活性，還能在儲存和運(yùn)輸過程中保持活力等；（6)用于生產(chǎn)的菌株還要必需符合我 國農(nóng)業(yè)部規(guī)定的《飼料添加劑品種目錄》。目前，乳酸菌是應(yīng)用最早、最廣泛的益生菌，是一 類能在利用碳水化合物發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的總稱，通常為厭氧或兼性厭氧 菌，在動物飼料中常用的有乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬和腸球菌屬。其中，肉雞飼喂乳酸桿菌 的研究越來越多，尤其乳酸菌制劑在肉雞生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用，它作為一種活性制劑能 夠提高肉雞生產(chǎn)性能和改善腸道環(huán)境。例如現(xiàn)有羅伊氏乳桿菌單一菌劑、卷曲乳桿菌單一 菌劑及其它們的復(fù)合制劑，每克活菌含量僅為l〇7c化，肉雞日增重均在50~52g;北京中農(nóng) 穎泰生物技術(shù)有限公司研制的高端乳酸菌微生態(tài)制劑，商品名康福特100,飼喂42天肉雞日 增重為51.97 ± 4.75g; CN201010527172.6公開了 一株植物乳桿菌及其應(yīng)用，該植物乳桿菌 對大腸桿菌、沙口氏菌W及金黃球菌等抑菌圈直徑均在12.36~14.92之間，抑菌作用較小。 同時由于飼養(yǎng)環(huán)境的差異，益生菌結(jié)果不一致性變得越來越復(fù)雜因此，尋找一種效果穩(wěn)定、 抑制效果良好、具有最佳肉雞日增重特點(diǎn)、可制備活性制劑的優(yōu)良乳酸菌菌種成為進(jìn)一步 研究的課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種優(yōu)良的植物乳桿菌JM113及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，從西藏林芝八一鎮(zhèn)散養(yǎng)藏雞盲腸內(nèi)容 物中分離得到一批乳酸菌，并從中發(fā)現(xiàn)一株植物乳桿菌，該菌對腸道中常見致病菌有很好 的抑制作用并且對胃腸道中的酸、膽鹽有一定的耐受性。此外，將該菌制成菌粉添加到肉 雞日糧中，可w顯著提高肉雞生產(chǎn)性能，并且與抗生素具有相似的促生長效果。將其命名為 植物乳桿菌Lactobacillus plan化r皿JM113,該菌株JM113已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中屯、，其簡稱為JM113,保藏編號為CCTCC Μ 2015680,保藏日期為2015年11月18日。保藏地 址:湖北省武漢市武昌塔挪山，武漢大學(xué)保藏中屯、。郵編:430072。
[0006] 本發(fā)明之一種乳酸球菌菌粉，包括植物乳桿菌JM113。
[0007] 本發(fā)明之一種乳酸球菌菌粉的制備方法，包括W下步驟：
[0008] (1)制備植物乳桿菌JM113的種子液；
[0009] (2)制備發(fā)酵液:將步驟（1)中制備的種子液轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，在36~38°C培 養(yǎng)12~24h，作為發(fā)酵用菌種；
[0010] (3)擴(kuò)大培養(yǎng):在發(fā)酵罐中加入液體培養(yǎng)基，119~125°C滅菌15~30min;滅菌完成 后降溫降至36~38°C;將步驟(2)中制備的發(fā)酵液W體積比為0.5~2%的比例接種到液體 培養(yǎng)基中；在溫度36~38°C，轉(zhuǎn)速100~30化pm，pH 6~7,連續(xù)發(fā)酵12~2地，即得發(fā)酵菌液；
[0011] (4)制備菌粉：將步驟（3)中所得的發(fā)酵菌液用超高速離屯、機(jī)W轉(zhuǎn)速6000~ 800化pm/min離屯、15~25min;棄上清液，收集菌泥，在菌泥中加入保護(hù)劑，加入量為菌泥重 的8~12%，然后攬拌均勻，冷凍干燥20~30h后研成粉末狀，即得植物乳桿菌JM113菌粉。
[0012] 進(jìn)一步，包括W下步驟：
[0013] (1)制備種子液:從平板上挑植物乳桿菌菌株JM113的單菌落接種到MRS液體培養(yǎng) 基，在37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h;
[0014] (2)制備發(fā)酵液:將步驟(2)中制備的種子液W體積比為1%的比例轉(zhuǎn)接到MRS液體 培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)16h，作為發(fā)酵用菌種；
[0015] (3)擴(kuò)大培養(yǎng):在發(fā)酵罐中加入MRS液體培養(yǎng)基，121°C滅菌20min;滅菌完成后，降 溫降至37°C;將步驟(2)中制備的發(fā)酵液W體積比為1%的比例接種到MRS液體培養(yǎng)基中；在 溫度37°C，轉(zhuǎn)速20化pm，pH 6.5，連續(xù)發(fā)酵16h，即得發(fā)酵菌液。
[0016] (4)制備菌粉:用超高速離屯、機(jī)將發(fā)酵菌液W轉(zhuǎn)速為8000巧m/min離屯、20min，棄上 清液，收集菌泥，在菌泥中加入保護(hù)劑，加入量為菌泥重的10%，然后攬拌均勻，冷凍干燥 24h后研成粉末狀，，即得乳酸球菌M23菌粉。
[0017] 進(jìn)一步，所述保護(hù)劑為脫脂奶粉與甘油W比例5:1的混合物。
[001引本發(fā)明之植物乳桿菌JM113在制備肉雞日糧中的應(yīng)用。
[0019] 進(jìn)一步，每千克日糧中含109c化所述植物乳桿菌JM113。
[0020] 本發(fā)明之植物乳桿菌菌粉在制備肉雞日糧中的應(yīng)用。
[0021] 進(jìn)一步，每千克日糧中添加1克所述植物乳桿菌菌粉。
[0022] 本發(fā)明之植物乳桿菌JM113可W較好地耐受胃腸道中不利于細(xì)菌生長的因素如 酸、膽鹽;對腸道致病菌大腸桿菌、鼠傷寒沙口氏菌、腸炎沙口氏菌、己氏桿菌W及金黃色葡 萄球菌的生長均有很好的抑制作用;具有較好的可發(fā)酵性，具有大量生產(chǎn)的潛力。本發(fā)明由 植物乳桿菌JM113制備成菌粉添加到肉雞日糧中，可W顯著提高肉雞的生產(chǎn)性能。
[0023] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明植物乳桿菌JM113在抑2.5、膽鹽濃度為0.2%的MRS培養(yǎng)基中 成活率分別為67.7%和100%;同時，本發(fā)明植物乳桿菌JM113對腸道致病大腸桿菌、鼠傷寒 沙口氏菌、腸炎沙口氏菌、己氏桿菌W及金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑可達(dá)17~20mm。本發(fā)明 植物乳桿菌JM113在PH 6.5、溫度37°C、轉(zhuǎn)速20化pm/min的條件下，可大量生長，發(fā)酵菌液經(jīng) 過低溫高速離屯、得到菌體，經(jīng)過24小時冷凍干燥，研磨制成菌粉，每克菌粉的活菌數(shù)高達(dá) lO^c化。肉雞日糧中添加本發(fā)明植物乳桿菌菌粉可使肉雞平均日增重可達(dá)58.2±1.6g，飼 料轉(zhuǎn)化率可達(dá)1.65 ± 0.04 %。
【附圖說明】
[0024] 圖1為植物乳桿菌JM113系統(tǒng)發(fā)育樹。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步加 W說明。
[00%]實(shí)施例1:植物乳桿菌JM113的分離
[0027] 1、菌株樣品：西藏的藏雞目前主要是W傳統(tǒng)的散養(yǎng)方式為主，其抗病力強(qiáng)，在生長 過程中沒有接觸過抗生素，可W作為一種理想的益生菌來源。樣品是從陜西楊凌地區(qū)散養(yǎng) 肉雞腸道中采集的，取腸道內(nèi)容物W及粘膜于4°C保存。
[0028] 2、培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基(Man Rogosa aiarp，MRS)，乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基，組成如 下：膜蛋白lOg/L，酵母提取物5g/L，牛肉膏l(xiāng)Og/L，Ξ水合乙酸鋼5g/L，葡萄糖20g/L，吐溫 801ml/L，憐酸氨二鐘2.0g/L，巧樣酸Ξ胺2.0g/L，屯水合硫酸儀0.58g/L，一水硫酸儘 0.25g/l，碳酸巧20g/L，瓊脂15g/L，蒸饋水1L。
[0029] 3、菌株的分離純化:采用倍比稀釋法涂布，37°C培養(yǎng)2地，挑取平板上有明顯溶巧 圈的單菌落，在平板上劃線，多次純化直到菌落的顏色、大小、形態(tài)完全一致;將純化的菌落 在平板上于4°C保存，菌液與50%的甘油1:1混合均勻后保存于-80°C冰箱。
[0030] 4、菌株形態(tài)特征及生理生化鑒定:將該植物乳桿菌在MRS固體培養(yǎng)基平板上37°C 培養(yǎng)24h，形成乳白色的圓形菌落，邊緣整齊光滑。經(jīng)鑒定，植物乳桿菌的生理生化特征為： 革蘭氏染色陽性、桿狀，出S反應(yīng)、過氧化氨酶、硝酸鹽還原、明膠液化均為陰性。
[0031] 5、活性菌株的分子鑒定:提取植物乳桿菌菌株的基因組，參照天根的DNA提取試劑 盒，PCR引物為細(xì)菌16S rRNA序列通用引物：
[0032] 正向引物27尸（5'-46461'1764了〇：了66(：1^46-3')，如沈0 10^:1所示；
[0033] 反向引物1492尺(5'-667^〇：1767^〔64(：1'1'-3')，如沈0 10備:2所示；
[0034] 擴(kuò)增菌株leSrRNA基因，PCR反應(yīng)體系：20微升體系，mix 10微升，上下游引物各1微 升，基因組1微升，滅菌水7微升。PCR反應(yīng)條件為:95°C10min; 95°C30s; 55°C30s; 72°C90s; 30 個循環(huán)，72°C延伸lOmiruPCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，用全式金的膠回收 試劑盒回收片段，樣品送南京金絲瑞測序公司測序。將測序的結(jié)果輸入NCBI網(wǎng)站上的BLAST 程序進(jìn)行比對，結(jié)果顯示植物乳桿菌JM113與GenBank基因庫中植物乳桿菌屬中的 Lactobacillus plantarum，Lactobacillus plantarum的 16S rRNA序列同源度最高，同源 率達(dá)96.06 %。
[0035] 6、菌株系統(tǒng)發(fā)育分析:將菌株的16S rRNA序列與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的植物 乳桿菌16S rRNA序列作比較，DNAStarlOO軟件包進(jìn)行多序列匹配排列并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu) 建，見圖1。從該菌16S rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上看，菌株JM1 13與植物乳桿菌 Lactobacillus發(fā)育關(guān)系最近，分在同一類群中，序列同源性為96.06%。根據(jù)生物學(xué)領(lǐng)域的 通常認(rèn)知，16S rRNA基因序列同源性小于93 %~95% ,可認(rèn)為屬于不同屬，同源性低于 98%，可W認(rèn)為屬于不同種。因此，基于系統(tǒng)發(fā)育樹和16S rRNA同源性角度，菌株JM113是乳 桿菌屬中的一個新成員，將其命名為Lactobacillus plantarum JM113。
[0036] 綜上，根據(jù)形態(tài)學(xué)特性、生理生化特征、分子生物學(xué)鑒定，并結(jié)合文獻(xiàn)報道，確定菌 株JM113為植物乳桿菌JM113。
[0037] 實(shí)施例2:植物乳桿菌JM11