本發(fā)明屬于食品
技術(shù)領(lǐng)域：
：，涉及植物乳桿菌st菌株及其在酸茶加工的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：中國是茶的國度，也是茶文化的起源地，對茶的描述最早可以追溯到上古的神農(nóng)時期，當(dāng)代的陸羽《茶經(jīng)》中就有記載：“茶之為飲，發(fā)乎神農(nóng)氏”。飲茶在我國已有幾千年的歷史，是人們普遍喜愛的日常飲料，目前已與可可、咖啡并稱為世界三大無酒精飲料之一。國內(nèi)外大量研究表明，茶葉中含有茶多酚、生物堿、茶多糖、茶色素等多種活性成分，其中茶多酚具有清除自由基、抗癌、抗突變、殺菌、降血壓、抗輻射、防止心血管疾病和糖尿病等多種多種保健功能。兒茶素類化合物為茶多酚的主體成分，占茶多酚總量的65％～80％，主要包括兒茶素(ec)、沒食子兒茶素(egc)、兒茶素沒食子酸酯(ecg)和沒食子兒茶素沒食子酸酯(egcg)4種物質(zhì)。云南省地處中國西南部，得天獨厚的自然條件和悠久的種茶歷史，孕育了豐富的茶樹種質(zhì)資源，是世界上茶樹的起源中心、原產(chǎn)地。居住在云南各地的少數(shù)民族種茶、制茶、愛茶，幾乎每個民族都保留著各具特色的飲(吃)茶方式，形成了自己獨特的飲食習(xí)慣和民間養(yǎng)生保健方法，創(chuàng)造了燦爛的名族文化。德昂族是我國跨境民族之一，長期居住在云南德宏、保山、臨滄等地的偏遠(yuǎn)山區(qū)，歷史上因交通閉塞、生產(chǎn)力落后、生活水平低等因素，缺醫(yī)少藥，倍受疾病的折磨。德昂族被稱為“古老的茶農(nóng)”，在與疾病的抗?fàn)幹?，德昂族?jīng)過長期的生活實踐，逐漸孕育出了酸茶等一些具有鮮明民族特色的民間養(yǎng)生保健方法，并延續(xù)至今?，F(xiàn)如今德昂酸茶制作工藝是在每年5、6月份在高溫高濕時節(jié)，德昂族采集大葉種茶樹鮮葉，經(jīng)晾曬、沖洗、蒸(煮)茶和揉茶，裝入竹筒之中，埋入地下發(fā)酵60-70天后，開水沖泡；也可以在發(fā)酵后再經(jīng)壓制和干燥制成茶磚，開水沖泡后飲用。從酸茶的加工工藝可以看出，目前酸茶的加工方法還僅僅停留在傳統(tǒng)經(jīng)驗上，酸茶產(chǎn)品普遍存在加工周期長、質(zhì)量不穩(wěn)定、品質(zhì)不統(tǒng)一、安全性難以保證等弊端。因此，規(guī)范酸茶加工方法，提高酸茶品質(zhì)，保證質(zhì)量穩(wěn)定，讓“藏在深閨人不識、微酸微苦味甘甜”的德昂族酸茶被世界認(rèn)可，具有廣闊前景和重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明從自然發(fā)酵酸茶中分離得到植物乳桿菌st，將植物乳桿菌st接種到酸茶發(fā)酵過程中，可以顯著提高酸茶中兒茶素總量，提高酸茶品質(zhì)，同時可以縮短加工周期，保證產(chǎn)品質(zhì)量。本發(fā)明的技術(shù)方案是：植物乳桿菌st，該植物乳桿菌2017年4月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為cgmccno.13911，分類命名為植物乳桿菌st。中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編：100101。該植物乳桿菌具有抑制主要腐敗菌和食源致病菌生長及促進(jìn)茶多酚生物轉(zhuǎn)化的能力，將植物乳桿菌st接種到酸茶加工過程中，可以縮短加工周期，保證產(chǎn)品質(zhì)量、提高酸茶品質(zhì)。應(yīng)用植物乳桿菌st加工酸茶的方法，其步驟如下：(1)清洗茶樹鮮葉，瀝干表面水分，將清洗后茶葉進(jìn)行蒸汽殺青；蒸汽殺青的時間點以茶鮮葉青草氣消失，葉色變黃為適度；(2)揉茶后，將茶葉置于玻璃瓶內(nèi)，壓緊；(3)接種植物乳桿菌st凍干菌粉，接種量為茶鮮葉重量0.02％，搖晃混勻；(4)密封玻璃瓶，置于25-37℃環(huán)境，發(fā)酵15d；(5)瀝干發(fā)酵后酸茶的表面水分后，加熱到75℃，倒入模具，壓制成型。本發(fā)明與傳統(tǒng)發(fā)酵相比，可顯著縮短酸茶生產(chǎn)周期。增加酸茶中主要兒茶素含量，提高酸茶品質(zhì)，而且加工過程可控，酸茶產(chǎn)品質(zhì)量一致。具體實施方式實例1植物乳桿菌st的篩選、鑒定1.植物乳桿菌st的篩選在無菌條件下，稱取1g左右的酸茶樣品，加入到10ml的pbs中，勻漿5min后，按1％的比例接種到含0.1％維生素c的mrs肉湯培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)18h。將富集后的培養(yǎng)液用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，在碳酸鈣-mrs固體培養(yǎng)基鋪板，37℃厭氧培養(yǎng)24h，從平板中挑取溶鈣圈大的單菌落。2.植物乳桿菌st的鑒定將從酸茶中分離得到的乳酸菌疑似菌株，擴大培養(yǎng)后采用甘油方法進(jìn)行保存。并對疑似菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，具體方法為：(1)提取乳酸菌疑似菌株的基因組；(2)以正向引物f:5’-agagtttgatcctggctcag-3’和反向引物r:5’-tacggctaccttgttacgactt-3’進(jìn)行16srdnapcr擴增。表1pcr擴增體系table1thepcrsystemforamplificationof16srdnapcr反應(yīng)條件為預(yù)變性(95℃，4min)；變性(94℃，30s)，退火(55℃，30s)，延伸(72℃，1.5min)，30個循環(huán)，最后延伸(72℃，10.0min)；對16srdna擴增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，拍照，記錄檢測結(jié)果；將擴增成功的pcr產(chǎn)物用冰袋保存寄到華大科技公司測序，測得菌株16srdna序列后，在ncbi上使用blast程序比對，與植物乳桿菌同源性大于99％，基于凡是16srdna可變區(qū)序列的同源性大于97.5％的便可認(rèn)為是同一個種的標(biāo)準(zhǔn)，該菌株為植物乳桿菌，命名為植物乳桿菌st。實例2植物乳桿菌st的抑菌特性采用瓊脂打孔擴散法，研究植物乳桿菌st對主要腐敗菌和食源性致病菌生長繁殖的抑制作用。植物乳桿菌st接種于mrs肉湯培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24h，4℃，5000rpm，離心10min，收集上清液。上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，用氫氧化鈉中和至ph6.5。將20μl培養(yǎng)24h的指示菌菌液(大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌和單胞李斯特菌)加入到融化并冷卻到45℃的1.2％tsa固體培養(yǎng)基中，劇烈混合后迅速倒入平皿中，待培養(yǎng)基凝固后用牛津杯在培養(yǎng)基上打孔(直徑8mm)，吸取90μl植物乳桿菌st培養(yǎng)液上清注入小孔中，鼠李糖乳桿菌gg為參照，滅菌的mrs液體培養(yǎng)基為空白對照，室溫下擴散4h后，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h后，測量抑菌圈直徑。植物乳桿菌st對三株腸道致病菌的抗菌活性結(jié)果表2所示，植物乳桿菌st能顯著抑制大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏、福氏志賀氏菌和單胞李斯特菌的生長，抗菌活性優(yōu)于參考益生菌菌株鼠李糖乳桿菌gg。表2植物乳桿菌st對腸道致病菌的抑制作用注：-,無抑菌圈；+,抑菌圈直徑<3mm；++,抑菌圈直徑在3-6mm之間；+++,抑菌圈直徑>6mm實例3植物乳桿菌st的茶多酚生物轉(zhuǎn)化能力將曬青毛茶水浸提液中接種植物乳桿菌st，37℃厭氧發(fā)酵48小時后，10000g，離心10分鐘，收集上清液，0.22μm無菌濾膜過濾，hplc-dad方法檢測egc、ec、egcg、ecg的含量。結(jié)果如表3所示，與毛茶浸提液相比，植物乳桿菌st發(fā)酵酸茶中的主要兒茶素總量提高了28.4％(p<0.05)，egc含量從原先的未檢出增加到95.2μg/ml(p<0.05)，ec含量增加了600％(p<0.05)，egcg含量降低了40.8％(p<0.05)，ecg含量降低了39.5％(p<0.05)。結(jié)果表明，植物乳桿菌st液態(tài)發(fā)酵酸茶促進(jìn)了兒茶素的生物轉(zhuǎn)化，egc和ec含量顯著增加。實例4接種植物乳桿菌st生產(chǎn)酸茶實驗1采摘茶樹鮮葉，用自來水清洗干凈，瀝干表面水分，經(jīng)蒸汽殺青和揉茶，表3酸茶植物乳桿菌液態(tài)發(fā)酵對酸茶中兒茶素含量注：同一行肩標(biāo)不同表示差異顯著(p<0.05)。置于無菌玻璃瓶內(nèi)，按茶鮮葉重量的0.02％稱取植物乳桿菌st凍干菌粉，用少量無菌水混合后，均勻噴灑到茶葉表面，壓緊茶鮮葉，不接種植物乳桿菌st組為對照。密封玻璃瓶，37℃發(fā)酵15d。瀝干發(fā)酵后酸茶的表面水分后，加熱到75℃，倒入模具，壓制成茶磚。采用酒石酸亞鐵分光光度法檢測茶多酚重量，hplc方法檢測兒茶素類含量。檢測結(jié)果如表4所示，與自然發(fā)酵酸茶相比，植物乳桿菌st發(fā)酵酸茶中的茶多酚總量無顯著變化，兒茶素總量提高了30.8％(p<0.05)，egc含量增加了70％(p<0.05)，ec含量增加了78.8％(p<0.05)，gcg和dl-c含量無顯著變化，egcg含量降低了39.8％(p<0.05)，egc含量降低了39.4％(p<0.05)。表4植物乳桿菌st發(fā)酵酸茶與自然發(fā)酵酸茶茶主要化學(xué)成分比較注：同一行肩標(biāo)不同表示差異顯著(p<0.05)。實例5接種植物乳桿菌st生產(chǎn)酸茶實驗2采摘茶樹鮮葉，用自來水清洗干凈，瀝干表面水分，經(jīng)蒸汽殺青和揉茶，置于無菌玻璃瓶內(nèi)，按茶鮮葉重量的0.02％稱取植物乳桿菌st凍干菌粉，用少量無菌水混合后，均勻噴灑到茶葉表面，壓緊茶鮮葉，不接種植物乳桿菌st組為對照。密封玻璃瓶，37℃發(fā)酵15d。瀝干發(fā)酵后酸茶的表面水分后，加熱到75℃，倒入模具，壓制成茶磚。采用酒石酸亞鐵分光光度法檢測茶多酚重量，hplc方法檢測兒茶素類含量。檢測結(jié)果如表5所示，與自然發(fā)酵酸茶相比，植物乳桿菌st發(fā)酵酸茶中的茶多酚總量無顯著變化，兒茶素總量提高了29.8％(p<0.05)，egc含量增加了72.1％(p<0.05)，ec含量增加了75.8％(p<0.05)，gcg和dl-c含量無顯著變化，egcg含量降低了40.9％(p<0.05)，egc含量降低了40.5％(p<0.05)。表5植物乳桿菌st發(fā)酵酸茶與自然發(fā)酵酸茶茶主要化學(xué)成分比較注：同一行肩標(biāo)不同表示差異顯著(p<0.05)。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12