低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶JB10NagA的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡 糖胺酶。
【背景技術(shù)】
[0002] 幾丁質(zhì)是由Ν-乙酰-D-胺基葡萄糖單體通過β_1，4鍵形成的多聚糖，廣泛存在于真 菌、昆蟲細(xì)胞壁以及甲殼類動(dòng)物外骨骼中，其蘊(yùn)藏量僅次于纖維素，居天然生物多聚高分子 的第二位，但大量的幾丁質(zhì)并未得到有效利用，每年超過80000噸的幾丁質(zhì)被廢棄(Patil et al.，Enzyme and Microbial Technology,2〇〇〇,26:473_483)。0-1^-乙酰葡糖胺酶屬于 幾丁質(zhì)降解酶系中的一種水解酶，可催化幾丁寡糖降解為N-乙酰-D-胺基葡萄糖單體，在幾 丁質(zhì)的徹底水解中起到關(guān)鍵性作用。根據(jù)氨基酸序列同源性，β-Ν-乙酰葡糖胺酶主要?dú)w類 于糖苷水解酶第3、20、73和84家族（Cantarel et al.，Nucleic acids research,2009,37: D233-D238)』-N-乙酰葡糖胺酶被廣泛應(yīng)用于功能性食品、保健品、化妝品、制藥、飼料添加 劑、生物燃料及生物防治等領(lǐng)域（Yang et al·，Journal of Agricultural and Food Chemistry ,2014,62 :5181-5190)。因?yàn)榇蠖鄶?shù)β-Ν-乙酰葡糖胺酶易受到水解產(chǎn)物即N-乙 酰-D-胺基葡萄糖的抑制，所以耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶可更有效地使幾丁質(zhì)徹底 水解;另外，β-N-乙酰葡糖胺酶可解除幾丁寡糖對內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的抑制作用，從而與內(nèi)切幾 丁質(zhì)酶產(chǎn)生協(xié)同作用（Yang et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014,62: 5181-5190)。耐鹽酶在高濃度NaCl下仍然具有催化活性，可應(yīng)用于高鹽食品和海 產(chǎn)品加工及其它高鹽環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域，在高鹽環(huán)境下加工食品還可以防止微生物的污染 并節(jié)省滅菌等所消耗的能源(Madern et al .Extremophiles,2000,4:91-98)。低溫酶在低 溫環(huán)境中具有較高的酶活，相對于中溫或高溫酶有其特有的應(yīng)用優(yōu)勢，如水產(chǎn)生境常常為 10-25°C;將中溫或者高溫加工的過程轉(zhuǎn)為低溫加工過程還可起到降低能耗的作用 (Cavicchioli et al .Microbial Biotechnology ,2011,4:449-460)。低溫耐鹽的β-N-乙酰 葡糖胺酶在降解海洋生物來源的幾丁質(zhì)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶，旨在解決 大量的幾丁質(zhì)并未得到有效利用的問題。
[0004] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶，所述低溫 耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0005] 進(jìn)一步，所述低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶本總共含666個(gè)氨基酸，理 論分子量為70.94kDa。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶 的制備方法，所述低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-N-乙酰葡糖胺酶的制備方法包括以下步驟：
[0007] 包含β-Ν-乙酰葡糖胺酶基因 jblOnagA的重組載體，重組載體為pEasy-E2- jblOnagA，將乙酰葡糖胺酶基因插入到表達(dá)載體中，使核苷酸序列與表達(dá)調(diào)控序列相連接， 用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[0008]培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA表達(dá)；
[0009]回收所表達(dá)的β-N-乙酰葡糖胺酶JBlONagA。
[0010] 進(jìn)一步，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，將重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 細(xì)胞BL21，得到重組菌株BL21 / jb 1 OnagA。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶 的重組載體。
[0012] 進(jìn)一步，所述重組載體是將乙酰葡糖胺酶基因插入到表達(dá)載體中，使核苷酸序列 與表達(dá)調(diào)控序列相連接。
[0013] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶 的重組菌株，重組菌株為BL21/jbl0nagA。
[0014] 本發(fā)明提供的低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶是一種新活性的β-Ν-乙 酰葡糖胺酶:該酶的最適pH值為6，在ρΗ5.0-7.0的范圍內(nèi)維持30 %以上的酶活性;經(jīng)ρΗ6.0-8.0的0.1Μ Mcl 1 vaine buffer處理lh，該酶酶活剩余85%以上；該酶最適溫度為50°C，在0 °(3、10°(3和20°(3分別具有2.0%、8.5%和22.5%活性 ;在30°(3以下處理111，該酶活力基本無 影響；在20 % (w/v)的NaCl中，該酶仍然具有55 %的活性;在反應(yīng)體系中加入終濃度為20mM 的N-乙酰-D-胺基葡萄糖時(shí)，該酶仍保留約82 %的活性;該酶可催化水解幾丁寡糖并與內(nèi)切 幾丁質(zhì)酶協(xié)同降解幾丁質(zhì)。本發(fā)明的β-Ν-乙酰葡糖胺酶可應(yīng)用于海產(chǎn)品加工、生物燃料、醫(yī) 學(xué)、功能性食品等行業(yè)。
【附圖說明】
[0015] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶制備方法流 程圖。
[0016] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的在大腸桿菌中表達(dá)的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA 的SDS-PAGE分析；
[0017]圖中:Μ:蛋白質(zhì)Marker; CK:含載體pEasy-E2大腸桿菌菌體破碎上清液;S1:含有重 組載體pEasy-E2-jblOnagA的大腸桿菌菌體破碎上清液;S2:純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶 JBlONagA。
[0018]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA的pH活性。 [0019]圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA的pH穩(wěn)定性。 [0020]圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA的熱活性。 [0021]圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA的熱穩(wěn)定性。 [0022]圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶JB 1 ONagA在不同濃度 NaCl中的活性。
[0023]圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶JB1 ONagA水解二乙酰殼 二糖及四乙酰殼四糖的產(chǎn)物分析；
[0024]圖中:M:N-乙酰-D-胺基葡萄糖;CK1:二乙酰殼二糖與滅活的JB10NagA;Sl:二乙酰 殼二糖與有活性的JB10NagA;CK2:四乙酰殼四糖與滅活的JB10NagA;S2:四乙酰殼四糖與有 活性的JBlONagA。
[0025] 圖9是本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA在不同濃度N-乙酰-D-胺基葡萄糖中的活性。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0027] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。
[0028]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶制備方法 包括以下步驟：
[0029] S101:包含β-Ν-乙酰葡糖胺酶基因 jblOnagA的重組載體，優(yōu)選為pEasy-E2- jblOnagA，將乙酰葡糖胺酶基因插入到表達(dá)載體中，使核苷酸序列與表達(dá)調(diào)控序列相連接， 用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[0030] S102:培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA表達(dá)；
[0031] S103:回收所表達(dá)的β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA。
[0032]本發(fā)明的低溫耐鹽耐產(chǎn)物抑制的β-Ν-乙酰葡糖胺酶可得自申氏桿菌（Shinella sp.);JB10NagA的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0033]申氏桿菌(Shinella sp.)，遺傳資源取自微生物，獲取方式為自行采集;于2010年 1 〇月由周峻沛在中國、云南省、紅河哈尼族彝族自治州采集。
[0034]本發(fā)明的β-Ν-乙酰葡糖胺酶JBlONagA總共含666個(gè)氨基酸，理論分子量為 70 · 94kDa。該酶的最適pH值為6，在pH5 · 0-7 · 0的范圍內(nèi)維持30 %以上的酶活性;經(jīng)pH6 · 0-8.0的0.1M Mcl 1 vaine buffer處理lh，該酶酶活剩余85%以上；該酶最適溫度為50°C，在0 °(3、10°(3和20°(3分別具有2.0%、8.5%和22.5%活性 ;在30°(3以下處理111，該酶活力基本無 影響；在20 % (w/v)的NaCl中，該酶仍然具有55 %的活性;在反應(yīng)體系中加入終濃度為20mM 的N-乙酰-D-胺基葡萄糖時(shí)，該酶仍保留約82 %的活性;該酶可催化水解幾丁寡糖并與內(nèi)切 幾丁質(zhì)酶協(xié)同降解幾丁質(zhì)。
[0035] 本發(fā)明提供了編碼上述β-Ν-乙酰葡糖胺酶的基因 jblOnagA，該基因序列如SEQ ID NO.