一種α-N-乙酰氨基葡糖苷酶活性檢測(cè)方法、底物和試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種α-N-乙酰氨基葡糖苷酶（EC3.2.1.50）酶活力檢測(cè)的方法，同時(shí)本發(fā)明還提供了測(cè)定α-N-乙酰氨基葡糖苷酶酶活性的底物和試劑，上述方法、底物和試劑可用于分析測(cè)定待測(cè)樣本（包括人體體液或組織或細(xì)胞樣本）中的α-N-乙酰氨基葡糖苷酶酶活力，主要應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域。采用本方法制備的測(cè)定試劑具有方便、快捷和高靈敏度的特點(diǎn)，便于推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】—種α-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶活性檢測(cè)方法、底物和試劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，同時(shí)又屬于遺傳代謝病的臨床診斷檢測(cè)領(lǐng)域。具體而言本發(fā)明提供了一種測(cè)定α -N-乙酰氨基葡糖苷酶（a -N-acetyIglucosaminidase,EC 3.2. 1.50)酶活力的方法，同時(shí)本發(fā)明還提供了一種作為α-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶(a -N-acetylglucosaminidase,EC 3. 2. I. 50)的酶活性檢測(cè)的底物,此外本發(fā)明還提供了測(cè)定α -N-乙酰氨基葡糖苷酶（a -N-acetylglucosaminidase, EC 3. 2. I. 50)酶活性的試劑。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]溶酶體是人體細(xì)胞內(nèi)一種由單位膜包裹的細(xì)胞器，內(nèi)部含有多種酸性水解酶，目前已發(fā)現(xiàn)的有60多種，如蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂酶、磷酸酶、溶菌酶等酶類。在細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶控制著多種內(nèi)源性和外源性大分子物質(zhì)的消化，如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖及糖原等，因此，溶酶體又被稱為細(xì)胞內(nèi)的消化器官。人體每天的新陳代謝會(huì)產(chǎn)生許多人體不需要的大分子物質(zhì)，如鞘脂、糖蛋白、粘脂、黏多糖、寡糖、糖原等，這些大分子物質(zhì)需經(jīng)過(guò)溶酶體酶處理后水解成小分子物質(zhì)方能繼續(xù)參與機(jī)體代謝或排出體外。如果溶酶體內(nèi)某種水解酶的活性降低或缺失將會(huì)導(dǎo)致特定的生物大分子不能正常降解而在溶酶體中貯積，從而使得溶酶體發(fā)生腫脹，細(xì)胞變得臃腫失常，細(xì)胞功能受到嚴(yán)重影響，最終導(dǎo)致一系列疾病，這類疾病統(tǒng)稱為溶酶體忙積癥（Lysosomal Storage Diseases,簡(jiǎn)稱LSDs)。依忙積的大分子物質(zhì)種類差異將溶酶體貯積癥分成以下幾種主要類型：粘多糖貯積癥、糖原累積病II型、黏脂質(zhì)貯積病、神經(jīng)鞘脂貯積病、糖蛋白貯積癥等。
[0004]據(jù)歐美國(guó)家初步統(tǒng)計(jì)資料表明，溶酶體貯積癥作為一個(gè)整體，在新生兒中患病率可聞達(dá)1/8，000~1/5，OOO0目如在中國(guó)尚未進(jìn)彳丁篩查統(tǒng)計(jì)，但隨著生化檢測(cè)技術(shù)的提聞，國(guó)內(nèi)溶酶體貯積癥的檢出率明顯提高，且呈逐步上升趨勢(shì)。
[0005]黏多糖忙積癥（mucopolysaccharidosis, MPS)是一組溶酶體忙積癥，是由于溶酶體內(nèi)某些水解酶缺陷，造成酸性黏多糖（葡糖氨基聚糖）降解受阻導(dǎo)致黏多糖在體內(nèi)積聚而引起一系列臨床癥狀的疾病。
[0006]黏多糖貯積癥屬先天性或原發(fā)性代謝異常綜合征。根據(jù)尿糖中所含酸性黏多糖的種類，相關(guān)個(gè)別酶缺乏或活性低下的種類以及臨床表現(xiàn)和影像學(xué)表現(xiàn)的不同，將黏多糖貯積癥分為7大類型，分別為：
MPS-I、MPS-II、MPS-111、MPS-IV,MPS-VI、MPS-VII、MPS-IX。
[0007]黏多糖貯積癥IIIB(MPS-IIIB)型為常染色體隱性遺傳疾病，是由于α -N-乙酰氨基葡糖苷酶（α -N-acetylglucosaminidase)功能低下或缺失所致,與MPS- III A>MPS- III C和 MPS- III D 同屬于 MPS- III型。
[0008]黏多糖貯積癥IIIB型確診困難表現(xiàn)在多方面：首先因該病是多系統(tǒng)疾病，涉及遺傳、神經(jīng)、肌肉、血液、骨骼、眼睛等器官或系統(tǒng)，癥狀表現(xiàn)復(fù)雜，并且與多種常見(jiàn)疾病有相似的臨床表現(xiàn)，因此醫(yī)生很難從癥狀表現(xiàn)上積累診斷經(jīng)驗(yàn)，因此漏診、誤診及延誤診斷的發(fā)生是普遍存在的問(wèn)題。其次醫(yī)院現(xiàn)有的各項(xiàng)常規(guī)檢查等輔助手段均難以達(dá)到確診的目的，如骨髓穿刺、體格檢查、心電圖、腦電圖、B超、CT/核磁、X線、肌肉活檢、血清肌酸磷酸激酶檢查等諸多檢查方法均無(wú)法對(duì)黏多糖貯積癥IIIB型的真正致病因素加以分析，因此不能對(duì)患者疾病作出準(zhǔn)確診斷?；驒z測(cè)困難重重，因單核苷酸序列多態(tài)性的存在，可能某些突變就是正常的，不會(huì)引發(fā)疾病，因此給分析帶來(lái)不確定性；另外由于酶的活性還與其他一些參與酶功能的基因有關(guān)，有很多這類基因目前還未被研究人員發(fā)現(xiàn)，因此基因檢測(cè)同樣不能作為診斷的可靠依據(jù)。
[0009]導(dǎo)致黏多糖貯積癥IIIB型產(chǎn)生的直接因素就是患者體內(nèi)單一 α -N-乙酰氨基葡糖苷酶活性降低或完全缺失，而且病情嚴(yán)重程度往往與酶活性殘留的比例密切相關(guān)，因此判斷患者α -N-乙酰氨基葡糖苷酶的活性是否正常，同時(shí)結(jié)合患者的臨床癥狀表現(xiàn)，就可以快速準(zhǔn)確地對(duì)病人的疾病作出診斷。因此α-N-乙酰氨基葡糖苷酶活性檢測(cè)作為黏多糖貯積癥IIIB型的診斷依據(jù)具有其他方法不能比擬的優(yōu)勢(shì)，臨床上通過(guò)對(duì)疑似黏多糖貯積癥IIIB型患者進(jìn)行α-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶活性檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)早診斷、早治療，對(duì)黏多糖貯積癥IIIB型預(yù)后，減少疾病給家庭及社會(huì)帶來(lái)的影響及隱患具有重要意義。國(guó)內(nèi)外臨床實(shí)踐證明檢測(cè)α-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶活性是輔助確診該病的最佳手段。本發(fā)明就是基于這些技術(shù)背景和社會(huì)現(xiàn)實(shí)需求，根據(jù)α-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶的酶催化活性的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成含有熒光基團(tuán)的α-Ν-乙酰氨基葡糖衍生物作為酶催化反應(yīng)的底物，從而可以快速靈敏的測(cè)定待測(cè)樣本中的α-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶酶活力。待測(cè)樣本中的α-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶可以將含熒光基團(tuán)的α-Ν-乙酰氨基葡糖水解后釋放出熒光分子和α-Ν-乙酰氨基葡糖，其水解底物的速率與釋放熒光分子的熒光強(qiáng)度成正比，這樣就可以計(jì)算待測(cè)樣本中的α-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶酶活力。采用本方法制備的測(cè)定試劑具有方便、快捷和高靈敏度的特點(diǎn)，便于推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明要解決的技`術(shù)問(wèn)題是：提供一種快速、準(zhǔn)確可靠的α -N-乙酰氨基葡糖苷酶（a -N-acetylglucosaminidase,EC 3. 2. I. 50)酶活力的突光檢測(cè)法，同時(shí)本發(fā)明還提供用于熒光法測(cè)定α-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶活性的檢測(cè)試劑，采用該方法和試劑可以在半自動(dòng)或全自動(dòng)的熒光光度計(jì)或酶標(biāo)儀等熒光檢測(cè)設(shè)備上使用，而且檢測(cè)靈敏度高，特異性高，操作簡(jiǎn)便，因而可以得到切實(shí)的推廣使用。
[0011]為解決技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：
本發(fā)明的α -N-乙酰氨基葡糖苷酶酶活性測(cè)定方法原理如下：
R- α -N-乙酰氨基葡糖+Η20π-ν-纖基麵苷酶R-OH + α -N-乙酰氨基葡糖。
[0012]具體為：α -N-乙酰氨基葡糖苷酶在特定條件下能夠水解合成的本身無(wú)熒光的底物R-a -N-乙酰氨基葡糖，釋放游離的熒光分子R-0H，在特定的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下可檢測(cè)到R-OH特異的熒光，由于a -N-乙酰氨基葡糖苷酶水解底物的速率與釋放熒光分子的熒光強(qiáng)度成正比，因此檢測(cè)在特定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)下的R-OH熒光值，就可以計(jì)算出a -N-乙酰氨基葡糖苷酶的酶活力。
[0013]a -N-乙酰氨基葡糖（a -N-acetyIglucosaminide)通用的結(jié)構(gòu)式為：
【權(quán)利要求】
1.一種α-N-乙酰氨基葡糖苷酶活性測(cè)定方法，其特征在于它的原理如下： R- α -N-乙酰氨基葡糖+ Η20 ° +纖基麵苷酶中R-OH + α -N-乙酰氨基葡糖。
2.具體為：α-N-乙酰氨基葡糖苷酶在特定條件下能夠水解合成的本身無(wú)熒光的底物R-α-N-乙酰氨基葡糖，釋放游離的熒光分子R-0H，在特定的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下可檢測(cè)到R-OH特異的熒光，由于α -N-乙酰氨基葡糖苷酶水解底物的速率與釋放熒光分子的熒光強(qiáng)度成正比，因此檢測(cè)在特定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)下的R-OH熒光值，就可以計(jì)算出α-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶的酶活力。
3.如權(quán)利要求書(shū)I所述的底物R-a-N-乙酰氨基葡糖，其特征在于它的通用結(jié)構(gòu)式為： 具體描述該結(jié)構(gòu)式的特征在于：在母體結(jié)構(gòu)（α -N-乙酰氨基葡糖）的I位C的醛基(-CH0)和具備熒光特征的R-OH特異連接生成R- α -N-乙酰氨基葡糖，生成的R- α -N-乙酰氨基葡糖已經(jīng)連接了熒光基團(tuán)R，但R-a -N-乙酰氨基葡糖本身不具備熒光特征。
4.當(dāng)a-N-乙酰氨基葡糖苷酶在特定條件下特異的水解R- a -N-乙酰氨基葡糖時(shí)又可以釋放出游離的具備熒光特征的R-OH分子。
5.如權(quán)利要求書(shū)I和2所述的底物R-a -N-乙酰氨基葡糖以及合成該底物的具備熒光特征的R-0H，其特征在于R-OH是在物理和化學(xué)領(lǐng)域普遍被接受的任何具備熒光特征且能與-CHO進(jìn)行反應(yīng)的分子。
6.如權(quán)利要求書(shū)1-3所述的底物R-a-N-乙酰氨基葡糖，其特征在于熒光分子R-OH是與a -N-乙酰氨基葡糖上的I位C上的醛基（-CHO)連接而形成R- a -N-乙酰氨基葡糖。
7.如權(quán)利要求書(shū)1-4所述的底物R-a-N-乙酰氨基葡糖，其特征在于氨基乙?；鶊F(tuán)是處在a -N-乙酰氨基葡糖分子的2位C上。
8.—種a-N-乙酰氨基葡糖苷酶活性檢測(cè)試劑，其特征在于其主要成分包括： 緩沖液20— 1000mmol/L pH 范圍3 — 9. 5 穩(wěn)定劑0.01% —10%
如權(quán)利要求書(shū)1-5所述的底物（R- a -N-乙酰氨基葡糖）0.02—10mmol/L 根據(jù)權(quán)利要求6所述a -N-乙酰氨基葡糖苷酶活性檢測(cè)試劑，其特征在于：由緩沖液、穩(wěn)定劑、R- a _N_乙酸氨基匍糖組成單劑試劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述a-N-乙酰氨基葡糖苷酶活性檢測(cè)試劑，其特征在于：由緩沖液、穩(wěn)定劑、R- a -N-乙酰氨基葡糖組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑組成；試劑2，由緩沖液、R- a -N-乙酰氨基葡糖組成。
10.9.根據(jù)權(quán)利要求6所述a -N-乙酰氨基葡糖苷酶活性檢測(cè)試劑，其特征在于：由緩沖液、穩(wěn)定劑、R- a -N-乙酰氨基葡糖組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑組成；試劑2，由R-a -N-乙酰氨基葡糖組成。
11.10.根據(jù)權(quán)利要求6-9所述a -N-乙酰氨基葡糖苷酶活性檢測(cè)試劑，其特征在于：所述的穩(wěn)定劑主要包括被物理和化學(xué)上普遍接受和使用的各種表面活性劑。
12.如權(quán)利要求6-9所述a-N-乙酰氨基葡糖苷酶活性檢測(cè)試劑，其特征在于：所述的緩沖液中的緩沖試劑是被物理和化學(xué)上普遍接受的能將體系的PH值緩沖或穩(wěn)定在3—9. 5的范圍中的試劑。
13.如權(quán)利要求書(shū)1-11所述的α-N-乙酰氨基葡糖苷酶活性檢測(cè)試劑，其特征在于，它可以用于檢測(cè)待測(cè)樣本中的α-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶的酶活力，特別是檢測(cè)人體體液或組織或細(xì)胞樣本中α-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶的酶活力，應(yīng)用到臨床檢測(cè)或診斷與α-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶的酶活力相關(guān)`的疾病。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103484525SQ201210195780
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月14日
【發(fā)明者】孫宏博 申請(qǐng)人:北京和信非凡生物技術(shù)有限公司