一種采用慢病毒技術(shù)構(gòu)建的抗腫瘤遷移藥物篩選細(xì)胞模型及其應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及藥物篩選領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)綠色熒光蛋白的Hep-G2細(xì)胞系。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤已成為目前威脅人類健康的頭號(hào)殺手，抗腫瘤藥物的研發(fā)和腫瘤的臨床治療成為科研的熱點(diǎn)，因此建立有效的抗腫瘤藥物篩選模型刻不容緩，腫瘤本身特有的迀移性和侵襲性是腫瘤逃避機(jī)體免疫應(yīng)答的重要機(jī)制，因此抑制腫瘤迀移性和侵襲性的藥物備受人們關(guān)注。
[0003]高通量藥物篩選技術(shù)是將多種技術(shù)方法有機(jī)結(jié)合而形成的新的技術(shù)體系，它以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。它的正常開展需要有一個(gè)高容量的化合物庫、自動(dòng)化的操作系統(tǒng)、高靈敏度的檢測系統(tǒng)、高效率的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)以及高特異性的藥物篩選模型。
[0004]綠色焚光蛋白(GreenFluorescent Protein，簡稱GFP)的基因是從Aequoreavictoria水母的基因組中提取獲得的，蛋白全長238AA，其65-67氨基酸殘基(絲氨酸一酪氨酸一甘氨酸)可自發(fā)的形成熒光發(fā)色團(tuán)，在藍(lán)色波長范圍的光線激發(fā)下，可以發(fā)出綠色熒光，吸收光譜的最大峰值為395nm，發(fā)射光譜最大峰值為509nm。如今GFP已作為報(bào)告基因被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)，遺傳學(xué)，器官移植等各個(gè)領(lǐng)域。而在腫瘤相關(guān)的基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)領(lǐng)域，GFP也發(fā)揮了極大的作用。
[0005]目前在真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建領(lǐng)域，病毒載體正越來越受到重視。目前常用的病毒載體包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、皰疹病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒中的慢病毒載體因其表達(dá)的穩(wěn)定性，包裝容量大以及能夠?qū)崿F(xiàn)多基因共感染等優(yōu)勢被廣泛使用于科研中。慢病毒感染能夠?qū)⒛康幕蛘先爰?xì)胞的基因組，所以不用再培養(yǎng)基中加入篩選壓力就能穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，大大簡化了實(shí)驗(yàn)過程，降低了成本。
[0006]目前使用的慢病毒包裝體系是由HIV病毒的基因組改造而成的。使用最廣泛的為第三代慢病毒，是一種三質(zhì)粒系統(tǒng)，能用于感染非分裂期的細(xì)胞。通過改造去除了不相關(guān)基因序列，并使用異源的部分基因代替同源基因(如:envelope-coding質(zhì)粒)來增加其安全性，同時(shí)對(duì)啟動(dòng)子等序列進(jìn)行修飾改造提高了病毒滴度和轉(zhuǎn)染效率。最后通過改造得到了自身失活型慢病毒載體(self-1nactivat1n，SIN)有著較高的滴度，轉(zhuǎn)染效率和安全性。而病毒獲得后除了能用于細(xì)胞的感染外，也能用于基因治療。
[0007]原發(fā)性肝癌(primary carcinoma of liver，以下簡稱肝癌)是我國常見的惡性腫瘤之一。在惡性腫瘤死亡順位中占第2位，在城市中僅次于肺癌;農(nóng)村中僅次于胃癌Aep-G〗細(xì)胞系來源于人類肝癌組織，是研究肝癌的常用細(xì)胞系。本發(fā)明使用慢病毒系統(tǒng)包裝綠色熒光蛋白(GFP)基因，通過慢病毒感染Hep-G2細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的Hep-G2細(xì)胞株。這一細(xì)胞株的建立大大簡化了體外藥物篩選的檢測手段，同時(shí)可以應(yīng)用于藥物對(duì)動(dòng)物腫瘤模型的療效方面的研究，實(shí)現(xiàn)腫瘤大小和分布的實(shí)時(shí)監(jiān)控和數(shù)據(jù)收集。。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能高通量篩選抗細(xì)胞迀移藥物的細(xì)胞模型。
[0009]解決本發(fā)明技術(shù)問題的技術(shù)方案為:一種篩選抗細(xì)胞迀移藥物的細(xì)胞模型，是通過慢病毒將綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)入到Hep_G2細(xì)胞系的基因組內(nèi)，獲得的穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的Η印-G2細(xì)胞株。
[0010]其中，上述細(xì)胞模型中的GFP基因能夠穩(wěn)定表達(dá)。
[0011]其中，上述細(xì)胞模型中的GFP序列為SEQ ID N0:1。
[0012]本發(fā)明還提供了一種制備上述篩選抗細(xì)胞迀移藥物細(xì)胞模型的方法，該方法包括以下步驟:將GFP基因克隆至prrl質(zhì)粒內(nèi)，構(gòu)建成prrl-CMV-GFP重組質(zhì)粒，將該質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)期的293T細(xì)胞，收獲純化病毒，病毒感染對(duì)數(shù)期Hep-G2細(xì)胞，經(jīng)有限稀釋法和熒光篩選，獲得本發(fā)明所述的細(xì)胞模型。
[0013]本發(fā)明還提供了一種抗細(xì)胞迀移藥物的篩選方法，該方法包括以下步驟:
a.取上述的用于篩選抗細(xì)胞迀移藥物的Hep-G2細(xì)胞模型接種于transwell小室的上室，篩選組的上室加入含待篩選物的維持培養(yǎng)基，下室加入含HGF的維持培養(yǎng)基；陽性對(duì)照組上室為維持培養(yǎng)基，下室加入含HGF的維持培養(yǎng)基；陰性對(duì)照組上室和下室均為維持培養(yǎng)基;
b.培養(yǎng)各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)各組迀移細(xì)胞數(shù)量，根據(jù)細(xì)胞迀移數(shù)的多少確定待篩選物是否為需要的潛在藥物，其中，上述的抗細(xì)胞迀移藥物篩選方法的細(xì)胞迀移數(shù)為從上室迀移至下室的細(xì)胞數(shù)量。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，在仔細(xì)分析不同感染技術(shù)的基礎(chǔ)上，選擇慢病毒包裝系統(tǒng)來制備穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的Hep_G2細(xì)胞株。本發(fā)明細(xì)胞模型中含有整合到基因組上的GFP基因的編碼序列，且該序列能夠穩(wěn)定表達(dá)。該細(xì)胞模型通過檢測熒光信號(hào)來直接進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，簡化了細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)的步驟和流程，為實(shí)現(xiàn)抗細(xì)胞迀移藥物高通量篩選奠定基礎(chǔ)。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，建立了制備上述篩選抗細(xì)胞迀移藥物的細(xì)胞模型的方法。該方法具體可通過以下步驟實(shí)施:
將Hep_G2細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期；
將裝載有GFP基因的慢病毒在polybrene的介導(dǎo)下感染Hep-G2細(xì)胞；
經(jīng)有限稀釋法和熒光顯微鏡篩選得到本細(xì)胞模型。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，建立起了以本發(fā)明細(xì)胞模型為基礎(chǔ)的抗細(xì)胞迀移藥物篩選方法，步驟如下:
a.取上述的用于篩選的細(xì)胞模型接種于transwell小室內(nèi)，細(xì)胞接種數(shù)目為2.5X104/孔-2X105/孔，優(yōu)選為5X104/孔。分組為篩選組、陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。其中篩選組的上室加入含待篩選物的維持培養(yǎng)基，下室加入含HGF的維持培養(yǎng)基；陽性對(duì)照組上室為維持培養(yǎng)基，下室加入含HGF的維持培養(yǎng)基；陰性對(duì)照組上室和下室均為維持培養(yǎng)基。
[0017]b.細(xì)胞孵育4_24h，優(yōu)選為24h，細(xì)胞固定后，無菌棉簽擦掉上室細(xì)胞，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)小室下表面4個(gè)固定視野區(qū)域的迀移細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)迀移細(xì)胞數(shù)量確定待篩選物是否為需要的潛在藥物。
[0018]其中，上述方法步驟a中加入的HGF的用量為12.5ng/ml-200ng/ml，優(yōu)選為lOOng/ml ο
[0019]本發(fā)明中涉及的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)及常規(guī)分子生物學(xué)的試驗(yàn)操作，都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參考現(xiàn)有的相關(guān)試驗(yàn)指南或儀器、試劑的使用說明能夠完成的。
[0020]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明細(xì)胞模型通過熒光顯微鏡可以直接觀察迀移細(xì)胞數(shù)，能夠高通量、高靈敏的準(zhǔn)確篩選抗細(xì)胞迀移藥物;本發(fā)明細(xì)胞模型的制備方法簡單可控，成本低廉;本發(fā)明抗細(xì)胞迀移藥物篩選方法步驟簡單，成本低廉，準(zhǔn)確性高，可實(shí)現(xiàn)高通量的篩選，具有很好的穩(wěn)定性和可靠性。為抗細(xì)胞迀移藥物的篩選提供了新的思路，具有很好的市場前景。
【附圖說明】
[0021 ] 圖1:prrl-CMV_GFP重組質(zhì)粒的酶切電泳圖。
[0022]圖2:Hep-G2-GFP細(xì)胞系穩(wěn)定性分析。其中第1代和第30代分別指第1代和第30代Hep-G2-GFP細(xì)胞系，明場是指明場下細(xì)胞照片，熒光場是指熒光場下細(xì)胞照片。
[0023]圖3:Hep-G2-GFP細(xì)胞系與野生型Hep_G2細(xì)胞系生長曲線比較。其中橫坐標(biāo)為細(xì)胞生長時(shí)間(培養(yǎng)時(shí)間)，縱坐標(biāo)為450nm單波長條件下測定的光度吸收值(波長450nm)o
[0024]圖4:Hep-G2-GFP細(xì)胞系與野生型Hep_G2細(xì)胞系在HGF作用下細(xì)胞迀移結(jié)果分辨率；
A為明場條件下HGF作用下Hep-G2-GFP細(xì)胞系迀移照片；
B為熒光