人WIPI2-shRNA慢病毒載體、構建方法與應用
【專利摘要】本發(fā)明屬于慢病毒載體制備領域，具體涉及一種人WIPI2?shRNA慢病毒載體、構建方法與應用，合成針對RNA干擾靶點序列的DNA oligo的正鏈和反鏈；所述的正鏈和反鏈退火形成帶粘性末端的雙鏈DNA；通過酶切使慢病毒載體線性化，使線性化載體與步驟（1）得到的雙鏈DNA連接；將連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，對得到的陽性克隆進行PCR鑒定；質粒抽提，用于下一步病毒包裝。本發(fā)明構建的人WIPI2?shRNA慢病毒載體，將載體質粒轉染后得到包裝并濃縮的病毒，病毒再侵染目的細胞，實現(xiàn)了WIPI2基因干擾，降低WIPI2基因的表達，降低被病毒侵襲的細胞生長速率，提高被病毒侵襲的細胞凋亡率。
【專利說明】
人WIP12-shRNA慢病毒載體、構建方法與應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于慢病毒載體制備領域，具體設及一種人WIPI2-shRNA慢病毒載體的構 建與應用。
【背景技術】
[0002] WIPI2的全稱為WD-repeat protein interacting with phosphoinositides 2， 它是WD重復蛋白家族的一個重要的成員，該蛋白家族的共性是具有WD基元，也稱為化P-ASP 或WD40,由40個左右氨基酸殘基組成，具有保守的GH( glycine-histidine)和WD (trypto地an-aspartic acid)序列，該基元在蛋白質的相互作用方面具有重要作用。目前 在跨膜信號轉導、物質運輸、RNA加工等過程中均起著重要作用。
[0003] 目前研究顯示W(wǎng)IPI2與自隧相關，它能夠與LC3和PI3P共同作用于自隧小體的形 成，并且通過招募自隧相關因子來清除病原體。但是WIPI2與腫瘤的關系未見報道，本發(fā)明 將WIPI2進行干擾后構建慢病毒載體發(fā)現(xiàn)能夠抑制肝癌細胞的生長，因此具有潛在的治療 肝癌的意義。

【發(fā)明內容】

[0004] 針對上述問題，本發(fā)明的目的之一是提供一種用于人WIPU-ShRNA慢病毒載體的 制備的WIPI2基因的ShRNA干擾序列。
[0005] 本發(fā)明的目的之二是提供人WIPU-ShRNA慢病毒載體。
[0006] 本發(fā)明的又一個目的是提供人WIPU-ShRNA慢病毒載體的構建方法。
[0007] 本發(fā)明的最后一個目的是提供人WIPU-ShRNA慢病毒載體的應用。
[000引為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為:WIPI2基因的ShRNA干擾序列，包括 DNA 0 1 i g 0的正鏈和反鏈，正鏈序列為5 '- CCGGGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATCTTTTTG-3 '，反鏈序列為5 ' - AATTCAAAAAGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATC-3 ' ；所述的正鏈和反 鏈退火形成帶粘性末端的雙鏈DNA。
[0009]人WIPU-ShRNA慢病毒載體，由權利要求1所述的雙鏈DNA插入慢病毒載體中制成。 [0010] 所述的人WIPI2-shRNA慢病毒載體針對的RNA干擾祀點序列為：5 ' - TACGGAAGATGTGTGCATT-3'。
[0011] 人WIPI2-shRNA慢病毒載體的構建方法，包括如下步驟：
[0012] (1)合成針對RNA干擾祀點序列的DNA OligO的正鏈和反鏈，正鏈序列為5/- CCGGGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATCTTTTTG-3 '，反鏈序列為5 ' - AATTCAAAAAGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATC-3 ' ；所述的正鏈和反 鏈退火形成帶粘性末端的雙鏈DNA;
[0013 ] (2)通過酶切使載體線性化，使線性化載體與步驟(1)得到的雙鏈DNA連接；
[0014] (3)將連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，對得到的陽性克隆進行PCR鑒定；
[0015] (4)質粒抽提，用于下一步病毒包裝。
[0016] 在步驟（1)中，將合成的DNA OligO的正鏈和反鏈的干粉溶解于退火緩沖液中，90 °C水浴15min;自然冷卻至室溫后，形成帶粘性末端的雙鏈；退火緩沖液含有Tris、EDTA、 NaCl。DNA 01 igo的正鏈和反鏈濃度分別為1 OOiiM。
[0017] 步驟(2)中，酶切反應溫度為37°C，酶切反應中加入AgeI和EcoRI;使線性化載體與 步驟(1)得到的雙鏈DNA連接時，于16 °C反應化-3h。
[0018] 步驟(3)中，將連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞的具體步驟為:將連接產物加入 到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，冰浴;熱激，冰浴;加入無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，搖床震蕩培 養(yǎng);取菌液均勻涂抹在含有Amp的LB固體培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；陽性克隆進 行PCR鑒定過程中采用的鑒定引物為鑒定引物-F: 5 ' -CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3 '和鑒 定引物-R: 5 ' -GTAATACGGTTATCCACGCG-3 '，具體過程為:挑取單菌落進行PCR擴增，電泳，巧U 序。
[0019] 步驟(4)中，將經(jīng)PCR鑒定合格的菌液轉接培養(yǎng)后，進行質粒抽提;所述的質粒用于 轉染293T細胞。
[0020] 人WIPI 2-shRNA慢病毒載體在制備ShRNA慢病毒W(wǎng)及作為制備降低WIPI2基因的表 達、降低被病毒侵襲的細胞生長速率或提高被病毒侵襲的細胞調亡率的試劑中的應用。
[0021] 人WIPU-ShRNA慢病毒載體在制備降低被病毒侵襲的肝癌細胞生長速率的試劑中 的應用。
[0022] 本發(fā)明構建的人WIPU-ShRNA慢病毒載體，將載體質粒轉染后得到包裝并濃縮的 病毒，病毒再侵染目的細胞，實現(xiàn)了 WIPI2基因干擾，降低WIPI2基因的表達，降低被病毒侵 襲的細胞生長速率，提高被病毒侵襲的細胞調亡率。
【附圖說明】
[0023] 圖1為GVl 15載體圖譜；
[0024] 圖2為線性化載體的瓊脂糖凝膠電泳圖片；
[0025] 圖3為PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖片；
[0026] 圖4為病毒感染細胞后GFP表達情況示意圖；
[0027] 圖5為WB驗證目的基因干擾有效性的結果示意圖；
[0028] 圖6為各樣品相對對照組樣品目的基因的相對表達水平示意圖；
[0029] 圖7為MTT檢測WIPI2基因干擾后對細胞生長的影響結果示意圖；
[0030] 圖8和圖9為流式細胞儀檢測WIPI2基因干擾后細胞調亡情況示意圖；
[0031] 圖10和圖11為WIPI2基因干擾后影響肝癌細胞增殖情況示意圖。
【具體實施方式】
[0032] W下將結合附圖和實施例詳細地說明本發(fā)明所設及實施例的技術方案。
[0033] 一、實驗材料
[0034] 1.實驗質粒
[0035] 本次實驗使用GV115載體，購自上海吉凱基因化學技術有限公司，載體圖譜如圖1。
[0036] 2.實驗菌株
[0037] TOPlO 大腸桿菌感受態(tài)細胞(TIANGEN, Cat. #CB104-03)
[003引 3.實驗試劑
[0039] 3.1酶類試劑
[0040；
[0041；
[0042；
[0043；
[0044；
[0045] 表2其它試劑
[0046] 3.3實驗儀器
[0047]
[004引 [0049]
[(K)加 ]
[0化1 ]
[0化2]
[0化3]
[0化4]
[0化5]
[0化6]
[0化7]
[0化引
[0化9] 表6 LB固體培養(yǎng)基組成
[0060]含氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中氨節(jié)青霉素的含量為10化g/ml。 [0061 ] 二、實驗方法
[0062] (一)RNA干擾祀點設計及雙鏈DNA OligO制備
[0064]
[0063] I.某巧信烏
[00化]……一，
[0066] 2. RNA干擾祀點設計
[0067] 根據(jù)RNA干擾序列設計原則，WWIPI2基因為模板，設計多個19-21nt RNA干擾祀點 序列。經(jīng)設計軟件評估測定后，選取W下序列作為干擾祀點。
[006引表8 RNA干擾祀點設計
[0069]
[0070] 3.DNA OligO序列合成
[0071] 根據(jù)已選祀點序列設計ShRNA干擾序列，并在兩端添加合適的限制性內切酶酶切 位點W完成載體構建。除此之外，在正鏈3 '端添加 TTTTT終止信號，而反鏈5 '端添加終止信 號互補序列。設計完成后送捷瑞公司合成單鏈DNA oligo。
[0073 J *CCGG:AgeI酶切位點;AATTC:EcoRI酶切位點;G:EcoRI酶切位點互補序列。
[0074] 表9 DNA OligO正反向序列
[0075] 4.雙鏈DNA OIigo制備
[0076] 將合成的單鏈DNA OligO干粉溶解于退火緩沖液中（終濃度IOOiiM)，90°C水浴 15min。自然冷卻至室溫后，形成帶粘性末端的雙鏈。終濃度指DNAligo干粉溶解在退火緩沖 液中的濃度為lOOyM。
[0077] (二)線性化載體制備
[007引按照肥B說明書配制50iil反應體系，使用AgeI和EcoRI雙酶切GVl 15載體使其線性 化。
[0079]
[0080] 表10載體酶切體系
[0081] 37°C(最適溫度)反應化，之后切膠回收目的片段。
[0082] 電泳上樣說明
[0083] 泳道1: Ikb Marker:從上至下依次為 10k:b，8化，6化，5k:b，4k:b，3.5k:b，3化，2.5k:b， 2k:b，I ? 5k:b，lk:b，750bp，500bp，250bp
[0084] 泳道2:Age I和EcoR I雙酶切線性化后的載體質粒
[0085] 泳道3:沒有酶切的載體質粒
[0086] 瓊脂糖凝膠電泳圖片如圖2。
[0087] (S)RNA干擾慢病毒載體構建
[0088] 1.連接
[0089] 按照F'ermentas T4 DNA Ligase說明書配制20山反應體系，將雙鏈DNA oligo與線 性化於
[0090]
[0091] 表11連接體系
[0092] 于16°C反應化-3h，連接產物命名為PSC42265,之后進行轉化實驗。
[OOW] 2.轉化
[0094]將連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，詳細操作步驟如下：
[00巧]1)將IOiil連接產物PSC42265加入到10化1大腸桿菌感受態(tài)細胞中，冰浴30min。
[0096] 2) 42 °C 熱激 90sec，冰浴 2min。
[0097] 3)加入50化L無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，200巧m于37°C搖床震蕩培養(yǎng)化r。
[009引4)取15化1菌液均勻涂抹在含有Amp的LB固體培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)箱中過夜培 養(yǎng)。
[0099] 3.陽性克隆的PCR鑒定
[0100] 3.1 引物
[0101]
[0102] 表12 PCR鑒定引物
[0103] 3.2 PCR擴增
[0104] 按下表配制20iU PCR反應體系，用無菌槍頭挑取單個菌落為模板，進行PCR擴增， 反應條件為：941：3111111;941：303,551：303,721：303,22次循環(huán)；721：5111111。？〇?結束后，取扣1 產物，1 %掠脂焼溢肪由統(tǒng)捻娜Il條帶。
[0105]
[0106]
[0107] 表13 PCR擴增體系
[010引電泳上樣說明
[0109] 泳道1:陰性對照(d地2〇)，排除系統(tǒng)中外源核酸污染導致假陽性結果
[0110] 泳道2:自連對照巧載體自連對照組）
[0111] 泳道3:250bp Marker:從上至下依次為f5kb，3kb，2kb，1. f5kb，Ikb，750bp，500bp， 250bp，IOObp
[0112] 泳道4-8:單克隆psc42265-l，2，3，4，5
[0113] 瓊脂糖凝膠電泳圖片如圖3。
[0114] PCR條帶大小
[0115] 連接入ShRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為:38化P;
[0116] 沒有連接入ShRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為:307bp。
[0117] 由此判斷psc42265-l，2,3,4,5為陽性克隆，保存鑒定結果正確的克隆，并進行測 序。
[011引4.陽性克隆測序結果分析
[0119] W鑒定引物-F進行陽性克隆測序，挑選測序結果與目標序列完全一致的克隆用于 下一步實驗。
[0120] PSC42265 測序結果：
[0121] ATATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATT TCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG ATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCAC ACATCTTCCGTATCTTTTTTGAATTCTCGACCTCGAGACAAATGGCAGTATTCATCCACGAATTCGGATCCATTAGG CGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGC CCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATT GACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTG
[0122] * ShRNA干擾序列插入片段用粗字體標注，其中AgeI酶切位點被破壞。
[0123] 質粒抽提
[0124] 將測序正確的菌液轉接于150ml含Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床震蕩培 養(yǎng)過夜。按照Endo化ee Maxi Plasmid Kit說明書提取質粒，質檢合格的質粒進入下游流 程。
[0125] 詳細操作步驟如下：
[01%] 1.8000巧m離屯、4min收集菌體。
[0127] 2.加入7ml P1，震蕩混勻；
[012引 3.加入7ml P3,顛倒混勻6~8次，靜置5min;
[0129] 4.加入7ml P4,顛倒混勻6~8次，冰浴IOmin;
[0130] 5.900化pm離屯、lOmin，將上清轉移到過濾器CS中，過濾后加入IOml異丙醇混勻；
[0131] 6.向吸附柱中加入2.5ml的平衡液化，800化pm離屯、2min，倒掉收集管中的廢液，將 柱子放回備用；
[0132] 7.將上清分兩次倒入吸附柱中，800化pm離屯、2min，棄廢液；
[0133] 8.向吸附柱中加入IOml漂洗液PW(已加入無水乙醇），相同轉速離屯、2min，棄廢液， 重復該步驟一次；
[0134] 10.向吸附柱中加入3ml無水乙醇，800化pm離屯、2min，棄廢液；
[01巧]11.950化pm空甩5min，除去殘留的漂洗液；
[0136] 將吸附柱轉移至一新的白管中，在柱中屯、滴加 80化1洗脫緩沖液TB(先預熱），室溫 放置5min，然后9500巧m離屯、2min;
[0137] 12.將管中的洗脫液轉移到一干凈的1. SndEP管中，-20°C保存；
[0138] 13.取樣電泳，使用分光光度計(Thermo_Nano化OP 2000)測定質粒濃度，質檢。
[0139] 14.將質檢合格的質粒進行下一步病毒包裝。
[0140] (四）病毒包裝
[0141] 1.轉染前2地，用膜蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細胞，W含10 %血清的培養(yǎng)基調 整細胞密度約5x 106細胞/15ml，重新接種于IOcm細胞培養(yǎng)皿，37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。 24h待細胞密度達70 %~80 %時即可用于轉染；
[0142] 2.轉染前化更換為無血清培養(yǎng)基；
[0143] 3.向一滅菌離屯、管中加入所制備的各DNA溶液(GV載體質粒20iig、p化Iper 1.0載 體質粒15]ig、p化Iper 2.0載體質粒IOyg)，不相應體積的吉凱轉染試劑混合均勻，調整總體 積為Iml，在室溫下溫育15min;
[0144] 4.混合液緩慢滴加至293T細胞培養(yǎng)液中，混勻，于37 °C、5 % C〇2細胞培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)；
[0145] 注:加入過程一定要均勻，盡可能地不要將細胞吹起。
[0146] 5.培養(yǎng)化后棄去含有轉染混和物的培養(yǎng)基，加入IOml的PBS液清洗一次，輕柔晃動 培養(yǎng)皿W洗涂殘余的轉染混和物后倒棄；
[0147] 6.緩慢加入含10 %血清的細胞培養(yǎng)基20ml，于37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48- 7化。
[0148] (五)病毒的濃縮與純化
[0149] 1.根據(jù)細胞狀態(tài)，收集轉染后4她(轉染即可計為化)的293T細胞上清液；
[0150] 2.于4°C、4000g離屯、lOmin，除去細胞碎片；
[0151] 3. Wo.45皿濾器過濾上清液于40ml超速離屯、管中；
[0152] 4.分別配平樣品，將帶有病毒上清液的超速離屯、管逐一放入至Beckman超速離屯、 機內，設置離屯、參數(shù)為2500化pm，離屯、時間為化，離屯、溫度控制在4°C ;
[0153] 5.離屯、結束后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒保存液(可用 PBS戒細胞培養(yǎng)基替代），輕輕反復吹打重懸；
[0154] 注:該步驟病毒回收會存在一定程度損失，盡可能地避免病毒長時間暴露在室溫 中。
[01巧]6.經(jīng)充分溶解后，高速離屯、1000化pm、5min后，取上清按要求分裝；
[0156] 7.準備樣品待檢測。
[0157] (六)病毒感染細胞
[0158] 培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的目的細胞，進行病毒感染。于巧光顯微鏡下觀察GFP表達情 況，巧光率達70-80 %左右，細胞匯合度達80 %左右，收集細胞進入下游實驗。
[0159] 感染結果說明：
[0160] 根據(jù)圖4,對照及目的慢病毒感染SMMC-7721細胞后72小時于顯微鏡下巧光觀察， 觀察結果顯示細胞感染效率約達到80%，細胞狀態(tài)正常。
[0161] (屯)WB驗證目的基因干擾有效性
[0162] 1)轉染前1天將生長良好的293T細胞按5X104/ml接種于24孔板中
[0163] 2)293T生長達 80 ~90% 融合時，換成 40化 W^opti-MEMl
[0164] 3)根據(jù)實驗脂質體說明書進行293T細胞轉染
[01化]4)將實驗組和對照組質粒和Iipofectamine 2000分別溶解于opti-MEM中，混勻， 室溫靜置5min
[0166] 5)將4.中稀釋好的質粒和稀釋好的Iipofectamine 2000混勻，室溫靜置20min
[0167] 6)把質粒DNA不Lipofectamine 2000的混合液加入293T細胞中，37°C5%C02培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)6~化，換成新鮮的含10%血清化完全培養(yǎng)液
[0168] 7)轉染后2地巧光顯微鏡下觀察預估轉染率
[0169] 8)轉染后36~4她收集細胞，抽提總蛋白進行western blot檢測
[0170] 根據(jù)圖5,從Western Blot結果可W看出，在293T細胞中，祀點對WIPI2基因化外源 表達在蛋白質水平有顯著化敲減作用。
[0171] (八)巧光定量PCR檢測目的基因干擾有效性
[0172] !.Total RNA抽提
[0173] 按照上海普飛公司Trizol試劑盒說明書抽提目的細胞to化1 RNA。
[0174] 詳細操作步驟如下：
[01巧]1)收集細胞，200化pm離屯、5min;去上清，細胞沉淀中加入1血Trizol;充分混勻后 室溫靜置5min，轉移至新的EP管中。
[0176] 2)加入2(K)化氯仿，顛倒混勻15s，室溫靜置lOmin。
[0177] 3)4°C、12800rpm，離屯、15min。
[0178] 4)轉移上層液體至新的EP管，加入等體積預冷的異丙醇，混勻后4°C靜置lOmin。 [01巧]5)4°C、12800巧m離屯、12min，棄上清。
[0180] 6)加入ImL 75%乙醇（用DEPC水新鮮配制），洗涂沉淀。
[0181 ] 7)4°C、11800巧m離屯、5min，棄去大部分上清。
[0182] 8)4°C、11800巧m再次離屯、5min，棄去上清，室溫干燥。
[0183] 9)加入RNase-打ee水至RNA沉淀完全溶解，Nano化OP 2000/2000C分光光度計分析
[0184] 測定RNA濃度及質量。
[01化]2.反轉錄獲得CDNA
[01化]按照Promega M-MLV試劑盒說明書將RNA反轉錄獲得cDNA。詳細操作步驟如下：
[0187] 1)按下表配制混合物，混勻后離屯、；70°C溫浴IOmin;之后立即置于冰水混合物中 冰浴，使Oligo肌和模板退火。
[0188] 試劑使用量
[0189] Oligo ?。?.5蛇/化） 化 1
[0190] Total RNA 2yl
[0191] RNase-Free 肥0 Up to IOyl
[0192] 2)按下表配制反應體系(冰上進行），加入步驟I制備的混合物中，混勻，短暫離屯、
[0193] 試劑使用量
[0194]
[01 巧]注：dNTPs 是 dATP，dCTP，dGTP，dTTP 的混合，濃度為 IOmM
[0196] 3)上述體系置于如下條件反應:42 °C反轉錄化，70°C IOmin使RT酶失活。將所得產 物cDNA-2(TC保存?zhèn)溆谩?br>[0197] 3.Real-Time qPCR基因表達檢測
[0198] 按照TAKARA SYBR Master Mixture試劑盒說明書進行目的基因 real-time qPCR 表達檢測。
[0199] 詳細操作步驟如下：
[0200] 1)按下表配置反應體系，進行qPCR擴增，反應條件為:95°C 15s ;95°C5s，60°C30s， 45次循環(huán)。在每一步的延伸階段讀取吸光值。
[0201] 試劑使用量
[0202]
[0203]
[0204] 2)qPCR結束后，制作烙解曲線，反應條件為:95°Clmin;冷卻至55°C，使DNA雙鏈充 分結合;從55°C開始到95°C，每增加 0.5°C，保持4S，同時讀取吸光值。
[02化]4.數(shù)據(jù)分析
[0206] 本實驗采用2-A AGt法分析數(shù)據(jù)：
[0207] A Ct=目的基因 Ct值-內參基因 Ct值；
[020引 -A A Ct =對照組A Ct平均值-各樣品A Ct值；
[0209] 2-AAet反映各樣品相對對照組樣品目的基因的相對表達水平
[0210] 根據(jù)圖6,經(jīng)ShRNA慢病毒感染3天后，實驗組SMMC-7721細胞中WIPI2基因在mRNA水 平的表達量受到抑制。
[0211] (九)MTT檢測WIPI2基因干擾后對細胞生長的影響
[0212] 1.將處于對數(shù)生長期的各實驗組細胞膜酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液， 并計數(shù)。
[0213] 2.根據(jù)細胞生長快慢決定鋪板細胞密度(多數(shù)為2000cell/well)，每組3-5重復， 根據(jù)實驗設計決定鋪板數(shù)量(檢測5天，則鋪5張 96孔板）。
[0214] 3.統(tǒng)一鋪好后，待細胞完全沉淀下來后，在顯微鏡下觀察各實驗組的細胞密度，如 果密度不均勻，則固定一組，微調其他組細胞的量再次鋪板(如:發(fā)現(xiàn)Con組細胞較多，降低 細胞量再次鋪板），放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0215] 4.從鋪板后第二天開始，培養(yǎng)終止前地加入20化5mg/mL的MlT于孔中，無需換液。
[0216] 5. 4h后完全吸去培養(yǎng)液，注意不要吸掉孔板底部的甲瑣顆粒，加 100化DMSO溶解 甲瑣顆粒。
[0217] 6.振蕩器振蕩2-5min，酶標儀490皿檢測OD值，根據(jù)圖7,實驗組SMMC-7721細胞化 增殖速率受到顯著抑制。
[021引7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
[0219] (十)流式細胞儀檢測WIPI2基因干擾后細胞調亡情況
[0220] 1.將SMMC-7721細胞分別鋪于6孔板中，按照W上慢病毒感染細胞方法將對照組慢 病毒載體和干擾組慢病毒載體分別感染肝癌細胞，繼續(xù)培養(yǎng)5天。
[0221] 2.膜酶消化，完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液，與上清細胞收集于同一 5mL離屯、管中， 每組設=個復孔。
[0222] 3. ISOOrmp離屯、5min，棄上清，4°C預冷的D-化址S(抑=7.2~7.4)洗涂細胞沉淀。
[0223] 4. 1 Xbinding buffer洗涂細胞沉淀一次，1300;rmp、3min離屯、，收集細胞。
[0224] 5. 200化 1 Xbinding buffer重懸細胞沉淀。
[02巧]6.加入10化Annexin V-APC染色，室溫避光10-15min。
[02%] 7.根據(jù)細胞量，補加 400-800化I Xbinding buffer,上機檢測。
[0227] ShRNA慢病毒感染SMMC-7721細胞，培養(yǎng)5天后，shWIPI2組與對照組（she化1)調亡 率對比，顯著增多（圖8和圖9)。
[02%](十一 )WIPI2基因干擾后影響肝癌細胞增殖情況
[0229] (1)準備感染后細胞:將處于對數(shù)生長期化各實驗組細胞膜酶消化，完全培養(yǎng)基重 懸，制成細胞懸液，計數(shù)。
[0230] (2)細胞接種:于6孔板培養(yǎng)板中各實驗組接種400-1000個細胞/孔(根據(jù)細胞生長 情況確定），每個實驗組設3個復孔。
[0231] (3)將接種好的細胞于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)到14天或絕大多數(shù)單個克隆中細胞數(shù)大 于50為止，中途每隔3天進行換液并觀察細胞狀態(tài)。
[0232] (4)實驗終止前巧光顯微鏡下對細胞克隆進行拍照，PBS洗涂細胞1次。
[0233] (5)每孔加入ImL 4%多聚甲醒，固定細胞30-60min，PBS洗涂細胞1次。
[0234] (6)每孔加入潔凈、無雜質GIEMSA染液500化，染細胞10-20min。
[0235] (7) d地20洗涂細胞數(shù)次，驚干，數(shù)碼相機拍照整，克隆計數(shù)。
[0236] ShRNA慢病毒感染3天后，細胞鋪于6孔板，鋪板量為600。8天后，觀察克隆數(shù)，發(fā)現(xiàn) 實驗組S匪C-7721細胞集落數(shù)目減少，提示W(wǎng)IPI2基因與S匪C-7721細胞的克隆形成能力顯 著相關(圖10和圖11)。
[0237] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術原理的前提下，還可W做出若干改進和變形，運些改進和變形 也應視為本發(fā)明化保護范圍。
【主權項】
1. ￥1?12基因的8111?財干擾序列，包括0財〇1丨8〇的正鏈和反鏈，正鏈序列為5'-CCGGGATACG GAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATCTTTTTG-3 '，反鏈序列為5 ' -AATTCAAAAAGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATC-3 ' ；所述的正鏈和反 鏈退火形成帶粘性末端的雙鏈DNA。2. 人WIPI2-shRNA慢病毒載體，由權利要求1所述的雙鏈DNA插入慢病毒載體中制成。3. 根據(jù)權利要求2所述的人WIPI2-shRNA慢病毒載體，其特征在于，所述的人WIPI2-shRNA慢病毒載體針對的RNA干擾靶點序列為:5' -TACGGAAGATGTGTGCATT-3'。4. 人WIPI2-shRNA慢病毒載體的構建方法，包括如下步驟： (1)合成針對RNA干擾靶點序列的DNA oligo的正鏈和反鏈，正鏈序列為5'-CCGGGATACG GAAGATGTGTGCATTCTCGAGAATGCACACATCTTCCGTATCTTTTTG-3 '，反鏈序列為5 ' -AATTCAAAAAGATACGGAAGATGTGTGCATTCTCGAGAAT GCACACATCTTCCGTATC-3 ' ；所述的正鏈和反 鏈退火形成帶粘性末端的雙鏈DNA; (2 )通過酶切使載體線性化，使線性化載體與步驟(1)得到的雙鏈DNA連接； (3 )將連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，對得到的陽性克隆進行PCR鑒定； (4)質粒抽提，用于下一步病毒包裝。5. 根據(jù)權利要求4所述的人WIPI2-shRNA慢病毒載體的構建方法，其特征在于，在步驟 (1)中，將合成的DNA oligo的正鏈和反鏈的干粉溶解于退火緩沖液中，水??；自然冷卻至室 溫后，形成帶粘性末端的雙鏈;退火緩沖液含有Tris、EDTA、NaCl。6. 根據(jù)權利要求4所述的人WIPI2-shRNA慢病毒載體的構建方法，其特征在于，步驟(2) 中，酶切反應中加入AgeI和EcoRI。7. 根據(jù)權利要求4所述的人WIPI2-shRNA慢病毒載體的構建方法，其特征在于，步驟(3) 中，將連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞的具體步驟為:將連接產物加入到大腸桿菌感受 態(tài)細胞中，冰浴;熱激，冰浴;加入無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，搖床震蕩培養(yǎng);取菌液均勻涂 抹在含有Amp的LB固體培養(yǎng)基上，于37° C培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；陽性克隆進行PCR鑒定過程中 采用的鑒定引物為鑒定引物-F : 5 ' -CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3 '和鑒定引物-R: 5 ' -GTAATACGGTTATCCACGCG-3 '，具體過程為:挑取單菌落進行PCR擴增，電泳，測序。8. 根據(jù)權利要求4所述的人WIPI2-shRNA慢病毒載體的構建方法，其特征在于，步驟(4) 中，將經(jīng)PCR鑒定合格的菌液轉接培養(yǎng)后，進行質粒抽提;所述的質粒用于轉染293T細胞。9. 人WIPI2-shRNA慢病毒載體在制備shRNA慢病毒以及作為制備降低WIPI2基因的表 達、降低被病毒侵襲的細胞生長速率或提高被病毒侵襲的細胞凋亡率的試劑中的應用。10. 人WIPI2-shRNA慢病毒載體在制備降低被病毒侵襲的肝癌細胞生長速率的試劑中 的應用。
【文檔編號】C12N15/867GK105925581SQ201610457343
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月22日
【發(fā)明人】袁獻溫, 丁義濤, 孫喜太, 施曉雷
【申請人】南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院