專利名稱：：一種可用于艾滋病基因治療的多靶點(diǎn)siRNA重組慢病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、病毒學(xué)和基因治療領(lǐng)域，更具體地涉及可用于艾滋病基因治療的多靶點(diǎn)siRNA重組慢病毒載體的構(gòu)建。
背景技術(shù)：
：由艾滋病毒(HIV)感染引起的獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是全世界面臨的主要健康威脅之一。據(jù)2008年11月30日發(fā)布的我國衛(wèi)生部、聯(lián)合國艾滋規(guī)劃署和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合對(duì)我國艾滋病疫的評(píng)估顯示截至2007年底，中國現(xiàn)存的艾滋病病毒感染者和病人約70萬人，其中艾滋病病人8.5萬，全人群感染率為0.05%。艾滋病疫情嚴(yán)峻，而目前仍然沒用有效的疫苗。盡管目前治療艾滋病的藥物(如"雞尾酒"療法HAART)能有效地延長(zhǎng)患者生存時(shí)間，但因長(zhǎng)期用藥引起的抗藥性及嚴(yán)重的副反應(yīng)使得該療法難以繼續(xù)進(jìn)行。因此，艾滋病新的治療方法亟待研發(fā)，而基于RNA干擾的基因治療技術(shù)給了我們新的希望。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)現(xiàn)象是生物界近十年以來最令人興奮的發(fā)現(xiàn)之一。它是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptJonalgenesilencing,PTGS)的過程。目前，RNAi機(jī)制已基本闡明內(nèi)源或外源的dsRNA(雙鏈RNA)在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer切割成帶2個(gè)堿基突出的3'末端的21~23nt的小干擾RNA(siRNA)，后者與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)結(jié)合。siRNA在RISC中被解鏈，其中反義鏈引導(dǎo)RISC靶向與之互補(bǔ)的mRNA，RISC則在互補(bǔ)序列中間切割mRNA，從而抑制靶基因的表達(dá)。目前，RNAi技術(shù)已廣泛應(yīng)用于抗病毒及腫瘤等疾病防治研究領(lǐng)域。在艾滋病防治方面，一個(gè)顯然易見的策略就是用siRNA靶向病毒基因。事實(shí)上，艾滋研究者們已經(jīng)設(shè)計(jì)出了siRNA耙向HIV-1的編碼序列以及非編碼序列(Aef，tef，grag,v7,eA7i/'廠ev丄T7)(Bodenefa/.，2004;Capodiciefa/.,2002;Novinaa/.,2002;Hana/.,2004;Jacqueefa/.，2002;l_eeefa/.,2002;Novinaa/.，2002)。'然而，這種干擾方法只是在短期有效。由于HIV突變率高，能改變病毒RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，能編碼RNAi阻遏物，以上能力使之能逃逸RNAi的抑制作用，這使得RNAi在長(zhǎng)期抑制HIV復(fù)制方面變得困難(Dasefa/.,2004;Westerhoutefa/.,2005)。為解決這一難題，我們可以設(shè)計(jì)出針對(duì)某一個(gè)病毒基因不同區(qū)域的多種siRNA,用這復(fù)合的siRNA去干擾病毒基因，可以有效延緩病毒逃逸的出現(xiàn)，這是因?yàn)椴《静豢赡芡瑫r(shí)改變多個(gè)序列而仍然保持其復(fù)制能力(Brakea/.，2008)。另一種防止病毒逃逸的策略是用siRNA干擾病毒完成其復(fù)制所必須的相關(guān)宿主蛋白，而千擾該蛋白不應(yīng)影響細(xì)胞正常功能。目前，符合這一要求的最理想的宿主耙點(diǎn)是作為HIV輔助受體之一的CCR5。有證據(jù)表明，CCR5對(duì)人體的正常生長(zhǎng)、分化及免疫功能并不是必需的。在歐美大約1。/。的人群天然缺失CCR5蛋白，而以上人群對(duì)HIV有著顯著的防御力?；谝陨媳尘?，本發(fā)明選擇了設(shè)計(jì)多種siRNA同時(shí)干擾HIV保守基因及宿主蛋白CCR5的策略，構(gòu)建siRNA重組慢病毒載體，以獲得干擾的疊加效應(yīng)、長(zhǎng)效抑制以及延緩病毒逃逸的效果?；诼《驹泽w的艾滋病基因治療的研究，在國際上已有研究進(jìn)入了臨床I/II期階段，其中一命名為"OZ1"的艾滋病基因治療試驗(yàn)在臨床II期取得了較大成功(Mitsuyasuefa/.,2009)。這項(xiàng)研究表明艾滋病基因治療是取代藥物治療的可行方式，患者可能無需依賴于長(zhǎng)期的藥物治療?；蛑未砹艘环N新的、具有潛力的、長(zhǎng)期有效的疾病控制方式，無疑為艾滋病治療開辟了新的途徑。與此相比，國內(nèi)在此研究領(lǐng)域差距甚遠(yuǎn)，這一方面說明，基因治療在艾滋病治療領(lǐng)域的應(yīng)用是一個(gè)明顯的趨勢(shì)；另一方面也顯示了在國內(nèi)填補(bǔ)這一領(lǐng)域的空白的必要性和緊迫性。本發(fā)明正是為填補(bǔ)這一空白，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)，在我國艾滋病基因治療領(lǐng)域?qū)⒖赡馨l(fā)揮重要作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種可用于艾滋病基因治療的多靶點(diǎn)siRNA重組慢病毒載體，該載體相比于單靶點(diǎn)siRNA重組慢病毒載體具有更高效率的抑制艾滋病毒復(fù)制的能力，能克服或延緩病毒逃逸，且適合于艾滋病基因治療。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明選擇了HIV保守基因(rev、pol、tat)及宿主膜蛋白CCR5作為耙標(biāo)，構(gòu)建出了單靶點(diǎn)、雙耙點(diǎn)、三靶點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體(共計(jì)12個(gè))，構(gòu)建方法如下1改造慢病毒載體pLentiLox3.7申請(qǐng)人改造的慢病毒載體是pLentiLox3.7(RubinsonandDillon,NatureGenetics,2003)。該載體含有一個(gè)鼠源U6啟動(dòng)子用來控制siRNA的表達(dá)，同時(shí)還含有報(bào)告基因EGFP便于流式細(xì)胞儀分選。為了使該慢病毒載體更適用于與人相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究(例如艾滋病基因治療的研究)，同時(shí)也為了避免串聯(lián)siRNA的啟動(dòng)子單一而引起同源重組導(dǎo)致siRNA表達(dá)框的丟失，申請(qǐng)人將該載體的鼠源U6啟動(dòng)子分別置換為人源U6啟動(dòng)子和人源H1啟動(dòng)子(人源U6啟動(dòng)子和人源H1啟動(dòng)子從Ambion公司產(chǎn)品pSilencer2.0—U6和pSilencer3.0JH1經(jīng)PCR獲得)，改造后的慢病毒載體分別命名為pLLU6、pLLH1;2單耙點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體的構(gòu)建(參見圖2步驟I):a、化學(xué)合成寡核苷酸鏈，格式如下有義鏈5'-(19N)-(TTCAAGAGA)-(N91)-TTTTTTC-3'反義鏈與有義鏈互補(bǔ)，且在5，端添加上TCGA以產(chǎn)生X/701粘性突出末端注1)19N表示siRNA靶點(diǎn)的19個(gè)堿基序列，N19表示19N的反向互補(bǔ)序列；2)(TCAAGAGA)指導(dǎo)生成siRNA前體shRNA(小發(fā)夾RNA)的"環(huán)，，區(qū)域，該序歹'J選自(Brummelkampefa/.,Science,2002)b、有義鏈、反義鏈退火，形成帶X/o1粘性末端和平末端的片段；c、將以上片段連接至載體pLLU6或pLLH1(載體由/CspA1和X/7o1雙酶切)；d、轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3感受態(tài)細(xì)胞(Stbl3菌株購自lnvitrogen公司)；e、篩選陽性克隆，并測(cè)序鑒定；3雙靶點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體的構(gòu)建(參見圖2步驟H):a、利用PCR從單耙點(diǎn)的siRNA重組慢病毒栽體中擴(kuò)增"U6/H1-siRNA"表達(dá)框，并用Sa/1、Xho1雙酶切使其帶有X/101粘性末端；對(duì)于"U6-siRNA"表達(dá)框，PCR引物序列如下上游引物U6-siR-1(5'-TAACGCeie^QCCCCAGTGGAAAGACGCGCA-3')Sa/1下游引物U6陽siR-2(5'-ATACCGCTCGAGCTCGTGAAGCGAGCTTATCGATACC陽3')對(duì)于"H1-siRNA"表達(dá)框，PCR引物序列如下上游引物H1-siR-1(5'-TAACGCGTCGACAATTCATATTTGCATGTCGC-3')Sa/15下游引物H1-siR-2(5'-ATACCGCTCGAGCTCGTGAAGCGAGCTTATCGATACC-3，)為1b、將"U6/H1-siRNA"表達(dá)框連接至經(jīng)X/)ol酶切的單靶點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽性克?。籧、測(cè)序鑒定；4三靶點(diǎn)的串聯(lián)siRNA重組慢病毒載體的構(gòu)建(參見圖2步驟III):將"U6/H1-siRNA"表達(dá)框插入至雙革巴點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體，即構(gòu)建出三靶點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體。本發(fā)明所構(gòu)建的單靶點(diǎn)、雙靶點(diǎn)及三靶點(diǎn)siRNA重組慢病毒載體如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>申請(qǐng)人將以上siRNA重組慢病毒載體分別與pNL4-3丄uc.R-E-(LandauNR,Viology,1995)以及pRL-TK(Renilla熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，購自Promega公司)共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，24小時(shí)后檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。結(jié)果表明各siRNA重組慢病毒載體對(duì)HIV的復(fù)制都有不同程度的抑制作用，其中rev-pol、rev-tat、pol-tatsiRNA的組合的效果高于其各自單獨(dú)發(fā)揮的作用，即具有疊加效應(yīng)。具體結(jié)果如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>其中，對(duì)HIV復(fù)制抑制水平最高的siRNA重組慢病毒載體是pLLH1CCR5_U6rev_U6tat(EscheA7'c/7/aco〃Stbl3/pLLH1CCR5_U6rev—U6tatCCTCCM209137),保藏日期2009年6月25日，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，i也址中國.武漢.武漢大學(xué)。(注CCR5siRNA表達(dá)框在上述實(shí)驗(yàn)中不發(fā)揮作用，因?yàn)樗玫腍EK-293T細(xì)胞不表達(dá)CCR5膜蛋白，且pNL4-3丄uc.R-E-為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，無需膜受體CCR5介導(dǎo))為了檢測(cè)siRNA重組慢病毒載體表達(dá)的CCR5siRNA的功能，申請(qǐng)人用以下siRNA重組慢病毒載體建立了基于GhostCD4/CCR5細(xì)胞(KewalRamaniVandLittmanDR，JVirol,1999)的穩(wěn)定細(xì)胞系pLLU6LucR(陰性對(duì)照)；pLLH1CCR5;pLLH1CCR5_U6rev—U6tat;然后用PE(Cy5)標(biāo)記的CCR5抗體(購自eBioscience公司)對(duì)以上穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行了流式4全測(cè)以測(cè)定CCR5膜蛋白表達(dá)水平(結(jié)果如圖6所示)。結(jié)果表明以pLLH1CCR5及pLLH1CCR5—U6revJJ6tat建立的基于GhostCD4/CCR5細(xì)胞的穩(wěn)定細(xì)胞系的CCR5表達(dá)水平顯著下調(diào)(分別下調(diào)77.5%和79.9%)。本發(fā)明的有益效果是(1)以上篩選到的高效siRNA重組慢病毒載體(pLLH1CCR5—U6rev—U6pol、pLLH1CCR5—U6revJJ6tat)適合于基于造血干細(xì)胞技術(shù)的艾滋病基因治療。在一個(gè)具體的方面，用以上siRNA重組慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)艾滋病人造血干細(xì)胞(如CD34+細(xì)胞)，分選轉(zhuǎn)導(dǎo)陽性細(xì)胞并回輸病人體內(nèi)，可進(jìn)行艾滋病基因治療；(2)本發(fā)明提供的siRNA重組慢病毒載體能同時(shí)表達(dá)針對(duì)3個(gè)靶點(diǎn)的siRNA,其抑制艾滋病毒的效率高于各siRNA單獨(dú)發(fā)揮的作用，即具有協(xié)同增效作用。因此，本發(fā)明提供的三靶點(diǎn)siRNA重組慢病毒載體具有更有效的抑制艾滋病毒復(fù)制的能力；(3)本發(fā)明提供的三靶點(diǎn)siRNA重組慢病毒載體能靶向與艾滋病毒復(fù)制相關(guān)的宿主膜蛋白CCR5，并同時(shí)靶向多個(gè)HIV保守基因，因此能避免或延緩病毒逃逸。圖1顯示了靶向HIV基因的siRNA靼點(diǎn)序列保守性。分析結(jié)果表明在rev、gag、pol、tat等4個(gè)siRNA靶點(diǎn)中，tatsiRNA靶點(diǎn)序列的保守性在不同HIV毒抹間最高。圖2是多靶點(diǎn)小千擾RNA的慢病毒載體的構(gòu)建流程圖。首先，通過KspA1和X/o1酶切位點(diǎn)將化學(xué)合成的編碼siRNA的寡核苷酸片段連接至pLLU6、pLLH1載體，獲得單靶點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體；然后，PCR擴(kuò)增"U6/H1-siRNA"表達(dá)框，連接至X/701酶切的單靶點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體，從而獲得雙把點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體；最后，依此策略構(gòu)建出三靶點(diǎn)siRNA的重組慢病毒載體。圖3顯示了siRNA重組慢病毒載體對(duì)HIV的抑制效果。其中NC為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示rev-pol、rev-tat、pol-tatsiRNA的組合的效果高于其各自單獨(dú)發(fā)揮的作用，具有協(xié)同增效作用；pLLH1CCR5JJ6revJJ6tat抑制效果最高，能下調(diào)HIV復(fù)制水平88.9%;圖4顯示了siRNA重組慢病毒載體劑量與HIV復(fù)制水平的關(guān)系。結(jié)果表明siRNA重組慢病毒載體對(duì)HIV的抑制水平與其劑量呈正相關(guān)性；圖5顯示了siRNA重組慢病毒載體作用時(shí)間與HIV復(fù)制水平的關(guān)系。結(jié)果表明siRNA重組慢病毒載體對(duì)HIV的抑制水平與其作用時(shí)間呈正相關(guān)性；圖6顯示了siRNA重組慢病毒載體表達(dá)的CCR5siRNA對(duì)CCR5膜蛋白的下調(diào)水平。結(jié)果表明以pLLH1CCR5及pLLH1CCR5—U6rev_U6tat建立的基于GhostCD4/CCR5細(xì)胞的穩(wěn)定細(xì)胞系的CCR5表達(dá)水平顯著下調(diào)(分別下調(diào)77.5%和79.9%)。8本發(fā)明。實(shí)施例1:靶向HIV基因的siRNA靶點(diǎn)序列保守性分析為了明確申請(qǐng)人所選擇的siRNA耙點(diǎn)序列在中國HIV主要流行毒抹中的的保守性，申請(qǐng)人應(yīng)用LosAlamosHIVSequenceDatabase中的Primalign軟件(http:〃www.hiv.lanl.gov/content/sequence/QUICK一ALIGN/QuickAlign.html)只十所選擇的rev、gag、pol、tat等4個(gè)siRNA耙點(diǎn)進(jìn)行了序列保守性分析(圖1)。分析結(jié)果表明在以上4個(gè)分析對(duì)象中，tatsiRNA靶點(diǎn)序列的保守性在不同HIV毒林間最高。本實(shí)施例中所選取的siRNA靶點(diǎn)序列如下(此表中附含CCR5靶點(diǎn)序列)靶基因靶點(diǎn)序列(5'—3')長(zhǎng)度(bp)參考文獻(xiàn)RevACTTACTCTTGATTGTAAC19Arteagaefs/"2003GagGTAGCAACTCTCTATTGTGTA21EleanorCaveefa/.,2006PolGTATAAACAATGAGACACCAG21Morris3/.，2005TatTATGGCAGGAAGAAGCGGA19CapodicisA,2002CCR5CGCTTCTGCAAATGCTGTT19AndersonJ3/.,2003實(shí)施例2:構(gòu)建siRNA重組慢病毒載體2.1改造慢病毒載體pLentiLox3.7申請(qǐng)人改造的慢病毒載體是pLentiLox3.7(RubinsonandDillon,NatureGenetics,2003)。該載體含有一個(gè)鼠源U6啟動(dòng)子用來控制siRNA的表達(dá),同時(shí)還含有報(bào)告基因EGFP便于流式細(xì)胞儀分選。為了使該慢病毒載體更適用于與人相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究(例如艾滋病基因治療的研究)，同時(shí)也為了避免串聯(lián)siRNA的啟動(dòng)子單一而引起同源重組導(dǎo)致siRNA表達(dá)框的丟失，申請(qǐng)人將該載體的鼠源U6啟動(dòng)子分別置換為人源U6啟動(dòng)子和人源H1啟動(dòng)子(人源U6啟動(dòng)子和人源H1啟動(dòng)子從Ambion公司產(chǎn)品pSilencer2.0—U6和pSilencer3.0—H1經(jīng)PCR獲得)，改造后的慢病毒載體分別命名為pLLU6、pLLH1;2.2單靶點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體的構(gòu)建(參見圖2步驟I):2.2.1化學(xué)合成寡核苷酸鏈，格式如下有義鏈5'-(19N)-(TTCAAGAGA)-(N91)國TTTTTTC國3'反義鏈與有義鏈互補(bǔ)，且在5，端添加上TCGA以產(chǎn)生乂/o1粘性突出末端注1)19N表示siRNA靶點(diǎn)的19個(gè)堿基序列，N19表示19N的反向互補(bǔ)序列；2)(TCAAGAGA)指導(dǎo)生成siRNA前體shRNA(小發(fā)夾RNA)的"環(huán)"區(qū)域，i亥序歹'J選自(Brummelkampefa/.，Science,2002)2.2.2有義鏈、反義鏈退火,形成帶Xho1粘性末端和平末端的片段；2.2.3將以上片段連接至載體pLLU6或pLLH1(載體由KspA1和X/o1雙酶切)；2.2.4轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3感受態(tài)細(xì)胞(Stbl3菌林購自lnvitrogen公司)；2.2.5篩選陽性克隆，并測(cè)序鑒定；2.3雙乾點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體的構(gòu)建(參見圖2步驟II):2.3.1利用PCR從單粑點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體中擴(kuò)增"U6/H1-siRNA"表達(dá)框，并用Sa/1、X/o1雙酶切使其帶有X/o1粘性末端；對(duì)于"U6-siRNA"表達(dá)框，PCR引物序列如下上游引物U6-siR-1(5'隱TAACGCGTCGACCCCCAGTGGAAAGACGCGCA-3')Sa/1下游引物U6隱siR-2(5'-ATACCGCTCGAGCTCGTGAAGCGAGCTTATCGATACC-3，)X/701對(duì)于"H1-siRNA"表達(dá)框，PCR引物序列如下上游引物H1-siR-1(5'-TAACGCGTCGACAATTCATATTTGCATGTCGC-3')Sa"下游引物H1-siR-2(5'-ATACCGCTCGAGCTCGTGAAGCGAGCTTATCGATACC-3')X/7012.3.2將"U6/H1-siRNA"表達(dá)框連接至經(jīng)X/70l酶切的單靶點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Stbl3感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽性克??；2.3.3測(cè)序鑒定；2.4三把點(diǎn)的串聯(lián)siRNA重組慢病毒載體的構(gòu)建(參見圖2步驟III):將"U6/H1-siRNA"表達(dá)框插入至雙靶點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體，即構(gòu)建出三靶點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體。本實(shí)施例所構(gòu)建的單靶點(diǎn)、雙靶點(diǎn)及三靶點(diǎn)siRNA重組慢病毒載體如下表所示單扭點(diǎn)pLLH1CCR5pLLU6revpLLU6polpLLU6tatpLLU6LucFpLLU6LucR雙靶點(diǎn)pLLH1CCR5一U6revpLLH1CCR5JJ6polpLLH1CCR5JJ6tat三耙點(diǎn)pLLH1CCR5JJ6rev—U6polpLLH1CCR5一U6rev—U6tatpLLH1CCR5JJ6pol—U6tat實(shí)施例3:siRNA重組慢病毒載體對(duì)HIV復(fù)制的抑制能力pNL4-3丄uc.R-E-(LandauNR,Viology,1995)是在HIV全長(zhǎng)克隆pNL4-3基礎(chǔ)上改造而來的Firefly熒光素酶基因(LucF)插入到nef基因里，2個(gè)移碼突變使得該克隆Env及Vpr缺失。申請(qǐng)人將以上siRNA重組慢病毒載體分別與pNL4-3丄uc.R-E-以及pRL-TK(Renilla熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，購自Promega公司)共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，24小時(shí)后檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性，結(jié)果如圖3所示(注pNL4-3丄uc.R-E-復(fù)制水平可以由Firefly熒光素酶活性代表；Renilla熒光素酶的活性值作為內(nèi)參；NC為陰性對(duì)照)。結(jié)果表明各siRNA重組慢病毒載體對(duì)HIV的復(fù)制都有不同程度的抑制作用，其中rev-pol、rev-tat、pol-tatsiRNA的組合的效果高于其各自單獨(dú)發(fā)揮的作用，即具有疊加效應(yīng)。具體結(jié)果如下表所示11HIV復(fù)制水平單靶點(diǎn)p匕LU6rev81.4%pLLU6pol67.8%pLLU6tat64.7%三輩巴點(diǎn)pLLH1CCR5JJ6revJJ6pol84.5%pLLH1CCR5JJ6rev—U6tat88.9%pLLH1CCR5JJ6pol一U6tat77.2%其中，對(duì)HIV復(fù)制抑制水平最高的siRNA重組慢病毒載體是pLLH1CCR5—U6rev一U6tat(Esc/e〃'c/7/'aco〃Stbl3/pLLH1CCR5_U6rev一U6tatCCTCCM209137)。(注CCR5siRNA表達(dá)框在上述實(shí)驗(yàn)中不發(fā)揮作用，因?yàn)樗玫腍EK-293T細(xì)胞不表達(dá)CCR5膜蛋白，且pNL4-3丄uc.R-E-為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，無需膜受體CCR5介導(dǎo))此外，申請(qǐng)人還對(duì)抑制效率最高的2個(gè)重組慢病毒載體(pLLH1CCR5—U6rev—U6pol,pLLH1CCR5—U6rev—U6tat)進(jìn)行了劑量及時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)(結(jié)果如圖4、圖5所示)，結(jié)果表明siRNA重組慢病毒載體對(duì)HIV的抑制水平與其劑量和作用時(shí)間呈正相關(guān)性。實(shí)施例4:串聯(lián)表達(dá)siRNA的慢病毒的包裝4.1轉(zhuǎn)染前24小時(shí)鋪HEK-293T細(xì)胞(購自CCTCC)于一個(gè)直徑7.5cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中；4.2轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度以40-60。/。為宜，以標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣轉(zhuǎn)染操作將以下質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)月包4(jgsiRNA重組慢病毒載體2jagpLP12mgpLP22mgpVSVG4.3轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)分別收集病毒上清(即細(xì)胞培養(yǎng)基)，并補(bǔ)足培養(yǎng)基；之后混合3次收集的病毒上清；4.4病毒滴度檢測(cè)將病毒上清以10倍梯度稀釋，分別感染HEK-293T細(xì)胞(培養(yǎng)基中加polybrene(購自SIGMA公司)，終濃度為8iug/ml),48小時(shí)之后流式檢測(cè)GFP陽性細(xì)胞比率，并以比率在0.1-10%之間的稀釋度計(jì)算出病毒滴度。實(shí)施例5:利用串聯(lián)表達(dá)siRNA的慢病毒建立穩(wěn)定細(xì)胞系。5.1用實(shí)施例4中所包裝的慢病毒以梯度m.o丄感染GhostCD4/CCR5細(xì)胞，感染48小時(shí)后流式檢測(cè)GFP陽性細(xì)胞比率，擇其比率10%以下者進(jìn)行無菌流式分選(注之所以選擇比率10%以下者，是為了避免細(xì)胞被慢病毒復(fù)感染而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性)；5.2傳代培養(yǎng)分選的細(xì)胞至細(xì)胞數(shù)量適宜；5.3再次流式檢測(cè)GFP陽性細(xì)胞比率，以確定穩(wěn)定細(xì)胞系的純度。實(shí)施例6:siRNA重組慢病毒載體表達(dá)的CCR5siRNA對(duì)CCR5的下調(diào)水平為了檢測(cè)siRNA重組慢病毒載體表達(dá)的CCR5siRNA的功能，申請(qǐng)人用以下siRNA重組慢病毒載體建立了基于GhostCD4/CCR5細(xì)胞(KewalRamaniVandLittmanDR,JVirol，1999)的穩(wěn)定細(xì)胞系pLLU6LucR(陰性對(duì)照)；pLLH1CCR5;pLLH1CCR5—U6rev—U6tat;然后用PE(Cy5)標(biāo)記的CCR5抗體(購自eBioscience公司)對(duì)以上穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行了流式檢測(cè)以測(cè)定CCR5膜蛋白表達(dá)水平(結(jié)果如圖6所示)。結(jié)果表明以pLLH1CCR5及pLLH1CCR5—U6rev—U6tat建立的穩(wěn)定細(xì)胞系的CCR5表達(dá)水平相比于陰性對(duì)照顯著下調(diào)，且此二者下調(diào)率無明顯差異(分別下調(diào)77.5%和79.9%)。該結(jié)果證實(shí)siRNA重組慢病毒載體表達(dá)的CCR5siRNA能顯著下調(diào)CCR5膜蛋白表達(dá)水平。頁SEQUENCELISTING<110>武漢大學(xué)<120>—種可用于艾滋病基因治療的多靶點(diǎn)siRNA重組慢病毒載體<130〉一種可用于艾滋病基因治療的多靶點(diǎn)siRNA重組慢病毒載體<140>2009100628518〈141〉2009-06-26〈160>5<170>Patentlnversion3.1<210>〈211>〈212><213〉<400>19DNA人工合成1acttactcttgattgtaac19〈210>2〈211〉21<212〉DNA<213>人工合成〈400〉2gtagcaactctctattgtgta21〈210>3〈211>21〈212〉DNA<213>人工合成〈400〉3gtataaacaatg鄰acaccag21〈210>4<211>19<212>DNA〈213>人工合成<400>4tatggcaggaagaagcgga19<210>5<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>5cgcttctgcaaatgctgtt19權(quán)利要求1、一種多靶點(diǎn)siRNA重組慢病毒載體，其特征在于EscherichiacoliStbl3/pLLH1CCR5_U6rev_U6tatCCTCCM209137。全文摘要本發(fā)明公開了一種可用于艾滋病基因治療的多靶點(diǎn)siRNA重組慢病毒載體，針對(duì)艾滋病毒保守基因(pol、rev、tat)以及艾滋病毒輔助受體(CCR5)為靶點(diǎn)構(gòu)建出了單靶點(diǎn)、雙靶點(diǎn)、三靶點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體共計(jì)12個(gè)，并從中篩選出最有效的siRNA重組慢病毒載體pLLH1CCR5_U6rev_U6tat(EscherichiacoliStbl3/pLLH1CCR5_U6rev_U6tatCCTCCM209137)。該載體是三靶點(diǎn)的siRNA重組慢病毒載體，較單靶點(diǎn)siRNA重組慢病毒載體具有更高效率的抑制艾滋病毒復(fù)制的能力，且能克服或延緩病毒逃逸，適合用于艾滋病基因治療。文檔編號(hào)C12N15/867GK101654686SQ20091006285公開日2010年2月24日申請(qǐng)日期2009年6月26日優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日發(fā)明者葉柳,郭德銀,宇陳,念項(xiàng)申請(qǐng)人:武漢大學(xué)