一種克百威氨基化半抗原的合成方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種克百威氨基化半抗原的合成方法及應(yīng)用，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 克百威(Carbofuran，CAR),化學(xué)名為2,3_二氫-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯，商品名為呋喃丹，屬于氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中做為廣譜性殺 蟲(chóng)、殺線(xiàn)蟲(chóng)劑，可以與膽堿酯酶不可逆結(jié)合，使得乙酰膽堿不能分解而蓄積在體內(nèi)，影響神 經(jīng)中樞傳導(dǎo)，具有神經(jīng)毒性?？税偻哂袃?nèi)吸性，可以被植物根部吸收并輸送到植物體各器 官，在土壤中不急降解，極易污染土壤和地下水源，給農(nóng)產(chǎn)品安全和環(huán)境帶來(lái)潛在威脅。近 年來(lái)克百威已被禁止用于蔬菜，但仍有不少違法使用現(xiàn)象，導(dǎo)致克百威在果蔬中時(shí)有檢出， 因此，加強(qiáng)農(nóng)產(chǎn)品中克百威農(nóng)藥殘留的檢測(cè)迫在眉睫。
[0003] 傳統(tǒng)的克百威殘留檢測(cè)多采用儀器分析法，需要昂貴的儀器設(shè)備和專(zhuān)業(yè)技術(shù)人 員，對(duì)檢材要求較高，樣品前處理和提純過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不能滿(mǎn)足現(xiàn)代檢測(cè)對(duì)現(xiàn)場(chǎng)、方便、快 速的要求?；诿庖叻磻?yīng)的酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金試紙條法操作簡(jiǎn)便，對(duì)樣本要求不高， 可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。免疫分析法的前提是特異性抗體的制備。克百威分子量為 221，是典型的小分子化合物，需要制備人工抗原，且本身不含有可偶聯(lián)的功能基團(tuán)，必須進(jìn) 行半抗原合成。目前國(guó)內(nèi)外普遍采用傳統(tǒng)的三光氣合成工藝制備克百威羧基化半抗原，由 于大量光氣和甲苯的使用，極易危害人體健康，造成環(huán)境污染。因此，本發(fā)明以呋喃酚為原 料，設(shè)計(jì)一種新的克百威氨基化半抗原合成方法，并制備了完全抗原，為建立克百威免疫檢 測(cè)技術(shù)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)三光氣傳統(tǒng)方法合成克百威羧基化半抗原的危害性，提供了一種新的 克百威氨基化半抗原合成方法，采用戊二醛法制備人工抗原，制備得到的半抗原和人工抗 原可用于克百威免疫分析方法研究。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案:第一步為氨基化半抗原的制備及檢測(cè)，以呋喃酚為原料，在三 乙酸催化下與二(對(duì)硝基苯)碳酸酯發(fā)生酯化反應(yīng)，用3_叔丁氧羰基氨基丙胺進(jìn)行胺解并N-Boc保護(hù)，在鹽酸二氧六環(huán)下脫保護(hù)，最終合成克百威氨基化半抗原;然后利用戊二醛法將 半抗原和載體蛋白上的氨基縮合，制備克百威人工抗原。其中克百威氨基化半抗原合成路 線(xiàn)為
[0006] 工藝步驟如下。
[0007] 1.克百威氨基化半抗原合成。
[0008] (1)將四口燒瓶置于磁力攪拌器上，配置溫度計(jì)。取一定量的呋喃酚溶于50mL二 氯甲烷(DCM)中，冰浴下加入三乙胺（Et3N)，攪拌10分鐘后，將二（對(duì)硝基苯）碳酸酯溶于 15mL二氯甲烷中，緩慢滴加到上述反應(yīng)體系中，控制反應(yīng)摩爾比為呋喃酚:二(對(duì)硝基苯)碳 酸酯=1:1;逐漸升溫至30°C，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小時(shí)，TLC板監(jiān)控反應(yīng)完成，展開(kāi)劑為石油醚：乙 酸乙酯=10:1，合成中間產(chǎn)物（II)。
[0009] (2)稱(chēng)取一定量經(jīng)三乙胺堿化的3-叔丁氧羰基氨基丙胺(與呋喃酚摩爾比為1:1)， 溶于10mL二氯甲烷中，在冰浴條件下加入到上述反應(yīng)液中，將溫度升到室溫并繼續(xù)攪拌過(guò) 夜;依次用50mL水和飽和食鹽水各洗滌2次;用無(wú)水硫酸鈉干燥后，過(guò)濾除去干燥劑，濾液經(jīng) 真空旋干后經(jīng)200-300目硅膠柱層析純化得到中間產(chǎn)物（III)，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯， 體積比為12:1，收率為65%。
[0010] (3)將步驟2得到的半抗原中間產(chǎn)物（III)溶于5mL1，4-二氧六環(huán)中，冰浴下加入 15mL鹽酸二氧六環(huán)，室溫反應(yīng)4小時(shí)后將析出固體用30mL石油醚洗滌3次，再以石油醚混合 固體，經(jīng)真空旋干除去水分，得到終產(chǎn)物(IV)，收率為67%。
[0011] 2.克百威人工抗原的合成。
[0012] (1)稱(chēng)取一定量的半抗原和載體蛋白牛血清白蛋白（BSA)溶解在5mL磷酸鹽緩沖液 中（PBS，0.01M，pH7.4)，室溫磁力攪拌下至充分溶解后，避光反應(yīng)并逐滴加入25%的戊二 醛(GA)溶液，控制反應(yīng)摩爾比半抗原:戊二醛:BSA=40~80:35:1，溫和攪拌反應(yīng)30分鐘后，向 反應(yīng)液中加入硼氫化鈉溶液至終濃度為10mg/mL，然后4°C避光反應(yīng)2小時(shí)，即得到人工抗原 混合液。
[0013] (2)將人工抗原混合液移入處理過(guò)的透析袋中，用0.01M的PBS緩沖液在4°C磁力 攪拌下透析2天，再用去離子水透析1天，每天更換3次透析液;透析結(jié)束后離心取上清，使用 凍干法將其制成粉末，即得到克百威人工抗原:CAR-BSA。
[0014] 3.克百威人工抗原的鑒定。
[0015]分別對(duì)半抗原、載體蛋白和人工抗原溶液進(jìn)行紫外掃描，根據(jù)載體蛋白在偶聯(lián)前 后紫外掃描光譜的變化情況來(lái)初步判斷人工抗原偶聯(lián)是否成功。然后，將所制備的人工抗 原免疫新西蘭大白兔，4免后第7天采集抗血清進(jìn)行檢測(cè)，判斷所制備的人工抗原是否具有 免疫原性。
[0016]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明是新型的克百威氨基化半抗原合成方法，該反應(yīng)合成 步驟簡(jiǎn)潔有效，避免了克百威羧基化半抗原合成中傳統(tǒng)三光氣法大量使用光氣和甲苯的危 害性，以呋喃酚為起始原料，通過(guò)酯化及胺解、Boc保護(hù)和脫保護(hù)反應(yīng)，最終合成克百威氨基 化半抗原;采用戊二醛法使半抗原和載體蛋白上的氨基進(jìn)行縮合，最大程度暴露克百威抗 原決定簇。免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明制備的半抗原和人工抗原可完全用于免疫分析中，滿(mǎn) 足國(guó)內(nèi)對(duì)克百威殘留的檢測(cè)需要。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1克百威氨基化半抗原的核磁圖。
[0018]圖2克百威人工抗原紫外掃描圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]為更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例 僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0020] 實(shí)施例1克百威氨基化半抗原的制備。
[0021] (1)將四口燒瓶置于磁力攪拌器上，配置溫度計(jì)。取2.6g呋喃酚溶于50mL二氯甲 烷中，冰浴下加入1.7g三乙胺，攪拌10分鐘后，將4.9g二(對(duì)硝基苯)碳酸酯溶于15mL二氯甲 烷中，緩慢滴加到上述反應(yīng)體系中，逐漸升溫至3