一種利用東方醋桿菌生產黃芪多糖的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及黃芪多糖的生產方法領域，具體涉及一種利用東方醋桿菌生產黃芪多糖的方法。
【背景技術】
[0002]黃芪來自于豆科植物膜莢黃芪或蒙古黃芪的干燥根，是臨床常用的中藥，其主要成分黃芪多糖具有提高免疫力、抗病毒、抗菌、抗氧化、調節(jié)血糖、護肝保腎等多種藥效作用?，F有技術中常用的黃芪多糖的提取方法主要有:水提醇沉法、微波提取法、堿浸提法、酶法提取法、超濾法和超聲提取等，其中水提醇沉法應用最廣，然而這些從黃芪中直接提取黃芪多糖的方法存在提取率低、穩(wěn)定性差、純化難度大、操作步驟復雜、周期長等問題。通過微生物發(fā)酵黃芪，不僅可以提高黃芪多糖的得率，同時在發(fā)酵過程中伴隨的某些成分的分解或轉化可能生成影響黃芪藥理作用的新藥有效成分，達到增效減毒的功能。
[0003]微生物轉化法生產黃芪多糖的其中一個關鍵問題是菌種的選擇，本發(fā)明利用了一種全新的東方醋桿菌，通過優(yōu)化得出其最佳的生產條件及發(fā)酵產生黃芪多糖的最佳條件。

【發(fā)明內容】

[0004]為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種利用東方醋桿菌生產黃芪多糖的方法。
[0005]本發(fā)明采用的技術方案為:
一種利用東方醋桿菌生產黃芪多糖的方法，包括以下步驟:
(1)黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:稱量魚肉蛋白胨5份、乳糖10份、酵母浸膏5份、磷酸氫二鉀2.5份、磷酸二氫鉀2.5份、黃芪粉80份和水1000份，加入500ml的三角瓶中，用棉塞塞住三角瓶后放入殺菌鍋中滅菌，殺菌鍋溫度為121°C，滅菌20min ;
(2)MRS肉湯培養(yǎng)基的制備:稱量酪蛋白酶消化物10份，牛肉膏粉10份，酵母膏粉4份，檸檬酸三銨2份，乙酸鈉5份，七水合硫酸鎂0.2份，四水合硫酸錳0.05份，磷酸二氫鉀2份，葡萄糖2份，吐溫-80 1份，水1000份，將上述成分加入水中，加熱溶解，校正pH為5.7±0.2，分裝在500ml的三角瓶中，用棉塞塞住三角瓶后放入殺菌鍋中，殺菌鍋溫度為121 °C，滅菌 20min ；
(3)東方醋桿菌的擴大培養(yǎng):將東方醋桿菌接入MRS肉湯培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)；
(4)發(fā)酵反應:將擴大培養(yǎng)后的東方醋桿菌接入黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量占發(fā)酵總體積的1%_3%，黃芪用量為8%，將盛有發(fā)酵培養(yǎng)基和東方醋桿菌的三角瓶放入搖床中發(fā)酵，反應48h-96h，初始pH為6.5 ;
(5 )分離與測定:發(fā)酵完畢后，將三角瓶中的混合液倒入離心杯，然后放入離心機中離心，離心結束后，取上清液置于4°C冰箱保存?zhèn)溆?，沉淀部分水煮后再離心，將兩次離心的上清液合并、濃縮后測量黃芪多糖的含量。
[0006]所述步驟(1)中黃芪粉是將潔凈的黃芪片粉碎后過5號藥篩制備而成的。
[0007]所述步驟(3)中擴大培養(yǎng)的的溫度為37°C，初始pH為5.7±0.2，生長周期為24-32ho
[0008]所述步驟(4)中東方醋桿菌的菌液濃度為2X 109-3X 109個/ml。
[0009]所述步驟(4)中搖床的溫度為27°C -37°C，轉速為80_100r/min。
[0010]所述步驟(5)中離心機的轉速為1500r/min。
[0011]所述步驟(5)中測量黃芪多糖的含量的方法是采用硫酸鋅和亞鐵氰化鉀處理發(fā)酵產物，用苯酸-硫酸法在490nm波長下測定。
[0012]東方醋桿菌的保藏名稱為Acetobacter orientalis，編號為T1-1，于2015年7月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為武漢大學，保藏編號為CCTCC NO: Μ2015455。東方醋桿菌來自于青藏高原特有的一種酸奶，菌落顏色呈乳白色培養(yǎng)后期菌落顏色變黃，菌落呈圓點狀中間凸起邊緣整齊，表面光滑濕潤，有特殊的酸味；革蘭氏反應呈陽性；光學顯微鏡下觀察，呈短桿狀。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供一種經濟、高效的生產黃芪多糖的方法，本方法所用發(fā)酵原料價格低廉、易采購，發(fā)酵過程簡單易控，對發(fā)酵設備及生產條件無特殊要求，常規(guī)發(fā)酵工廠的設備及生產條件即可生產，較易實現工業(yè)化大生產，本發(fā)明采用的生產黃芪多糖的方法比水提法得到的黃芪多糖的含量高約10%。
【具體實施方式】
[0014]一種利用東方醋桿菌生產黃芪多糖的方法，包括以下步驟:
(1)黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:稱量魚肉蛋白胨5份、乳糖10份、酵母浸膏5份、磷酸氫二鉀2.5份、磷酸二氫鉀2.5份、黃芪粉80份和水1000份，加入500ml的三角瓶中，用棉塞塞住三角瓶后放入殺菌鍋中滅菌，殺菌鍋溫度為121°C，滅菌20min ;
(2)MRS肉湯培養(yǎng)基的制備:稱量酪蛋白酶消化物10份，牛肉膏粉10份，酵母膏粉4份，檸檬酸三銨2份，乙酸鈉5份，七水合硫酸鎂0.2份，四水合硫酸錳0.05份，磷酸二氫鉀2份，葡萄糖2份，吐溫-80 1份，水1000份，將上述成分加入水中，加熱溶解，校正pH為5.7±0.2，分裝在500ml的三角瓶中，用棉塞塞住三角瓶后放入殺菌鍋中，殺菌鍋溫度為121 °C，滅菌 20min ；
(3)東方醋桿菌的擴大培養(yǎng):將東方醋桿菌接入MRS肉湯培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)；
(4)發(fā)酵反應:將擴大培養(yǎng)后的東方醋桿菌接入黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量占發(fā)酵總體積的1%_3%，黃芪用量為8%，將盛有發(fā)酵培養(yǎng)基和東方醋桿菌的三角瓶放入搖床中發(fā)酵，反應48h-96h，初始pH為6.5 ;
(5 )分離與測定:發(fā)酵完畢后，將三角瓶中的混合液倒入離心杯，然后放入離心機中離心，離心結束后，取上清液置于4°C冰箱保存?zhèn)溆?，沉淀部分水煮后再離心，將兩次離心的上清液合并、濃縮后測量黃芪多糖的含量。
[0015]所述步驟(1)中黃芪粉是將潔凈的黃芪片粉碎后過5號藥篩制備而成的。
[0016]所述步驟(3)中擴大培養(yǎng)的的溫度為37°C，初始pH為5.7±0.2，生長周期為24-32ho
[0017]所述步驟(4)中東方醋桿菌的菌液濃度為2X109-3X109個/ml。
[0018]所述步驟(4)中搖床的溫度為27°C -37°C，轉速為80_100r/min。
[0019]所述步驟(5)中離心機的轉速為1500r/min。
[0020]所述步驟(5)中測量黃芪多糖的含量的方法是采用硫酸鋅和亞鐵氰化鉀處理發(fā)酵產物，用苯酸-硫酸法在490nm波長下測定。
[0021]實施例1
一種利用東方醋桿菌生產黃芪多糖的方法，包括以下步驟:
(1)黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備:稱量魚肉蛋白胨0.5g、乳糖lg、酵母浸膏0.5g、磷酸氫二鉀0.25g、磷酸二氫鉀0.25g、黃芪粉8g、水100ml，加入500ml的三角瓶中，用棉塞塞住三角瓶后放入殺菌鍋中滅菌，殺菌鍋溫度為121°C，滅菌20min ;所述黃芪粉是將潔凈的黃芪片粉碎后過5號藥篩制備而成的；
(2)MRS肉湯培養(yǎng)基的制備:稱量酪蛋白酶消化物10份，牛肉膏粉10份，酵母膏粉4份，檸檬酸三銨2份，乙酸鈉5份，七水合硫酸鎂0.2份，四水合硫酸錳0.05份，磷酸二氫鉀2份，葡萄糖2份，吐溫-80 1份，水1000份，將上述成分加入水中，加熱溶解，校正pH為5.7±0.2，分裝在500ml的三角瓶中，用棉塞塞住三角瓶后放入殺菌鍋中，殺菌鍋溫度為121 °C，滅菌 20min ；
(3)東方醋桿菌的擴大培養(yǎng):將東方醋桿菌接入MRS肉湯培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)；擴大培養(yǎng)的的溫度為37°C，初始pH為5.7 ±0.2，生長周期為24_32h ;
(4)發(fā)酵反應:將擴大培養(yǎng)后的東方醋桿菌接入黃芪多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量占發(fā)酵總體積的1%，黃芪用量為8%，將盛有發(fā)酵培養(yǎng)基和東方醋桿菌的三角瓶放入搖床中發(fā)酵，反應48h，初始pH為6.5 ;東方醋桿菌的菌液濃度為2X 109-3X 109個/ml ;搖床的溫度為 37°C，轉速為 100r/min ；
(5 )分離與測定:發(fā)酵完畢后，將三角瓶中的混合液倒入離心杯，然后放入離心機中離心，離心機的轉速