一種快速檢測雞白痢沙門氏菌的pcr-hrm引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是微生物檢測，分子診斷。具體涉及一種快 速檢測雞白痢沙門氏菌的PCR-HRM引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞白痢沙門氏菌（SalmonellaPullorum)屬于腸道桿菌科沙門氏菌屬，D血清 型中的一員。主要感染雞和火雞，臨床表表現(xiàn)以雛雞拉白色糊狀稀糞為特征，死亡率高。 Rettger于1899年首次報(bào)道了雞白痢沙門氏菌病，次年將本病命名為"雛雞致死性敗血 癥"1929年正式將本病命名為"雞白痢"。在所有飼養(yǎng)雞和火雞的地區(qū)均有本病的發(fā)生和存 在，在哺乳動(dòng)物中，兔具有高度易感性，有人曾在豬體內(nèi)分離到該菌，兒童亦偶有感染本病 的報(bào)道。目前，受沙門氏菌污染的家禽及相關(guān)產(chǎn)品已經(jīng)成為人類沙門氏菌感染和食物中毒 的主要來源之一。另外，隨著養(yǎng)禽業(yè)的迅猛發(fā)展，雞白痢沙門氏菌病已成為家禽最總要的細(xì) 菌病之一，并列為國家規(guī)定凈化的細(xì)菌病，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失非?？捎^。
[0003] 快速鑒別和診斷雞白痢沙門氏菌是凈化和防治的基礎(chǔ)，傳統(tǒng)的鑒定方法周期長、 靈敏度低、特異性差，如采集完樣品需要預(yù)增液BPW增菌（8~18h)，然后選擇性增菌液 (TTB、SC等）培養(yǎng)（18~24h)，再把增菌液接種到顯色平板上培養(yǎng)（18~24h)，接著挑 選可疑菌落進(jìn)行生化鑒定及血清學(xué)鑒定（12~48h)。利用血清學(xué)診斷與雞傷寒沙門氏菌 (Salmonella Gallinarum)具有很高的交叉凝集反應(yīng)性。另外，腸炎沙門菌（9,12:g，m:_) 的無動(dòng)力變種（9,12因失去Η相（g，m)抗原表達(dá)能力而無法用診斷血清確認(rèn)（g和m 因子），而純粹依據(jù)抗原式（9,12:-:-)則會(huì)誤判為雞白痢沙門氏菌，所以在國家提倡凈化 養(yǎng)殖場沙門氏菌的背景下，尋找一種高效、特異、快速的雞白痢沙門氏菌檢測方法具有重要 的公共衛(wèi)生意義和經(jīng)濟(jì)效益。
[0004] 高分辨率恪解曲線（high-resolutionmelting，HRM)是一種基于單核苷酸恪解 溫度不同而形成不同形態(tài)熔解曲線的基因分析新技術(shù)，具有極高的敏感性，可以檢測出單 個(gè)堿基的差異，SNP位點(diǎn)堿基不同會(huì)使雙鏈DNA的Tm值發(fā)生變化從而雙鏈DNA在升溫過程 中先后解開，形成不同的融解曲線形狀，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從熒光強(qiáng) 度與時(shí)間曲線上就可以判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點(diǎn)、雜合子與純合子等都會(huì)影響 熔解曲線的峰形，因此HRM分析能夠有效區(qū)分不同SNP位點(diǎn)與不同基因型。SYBR?GreenI 對(duì)PCR有抑制作用，必需使用低濃度；即使是高濃度也不能飽和插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小 溝，非飽和態(tài)結(jié)合使染料在熔解過程中發(fā)生重排，染料分子重新結(jié)合到雙鏈DNA的空置位 點(diǎn)，造成熒光信號(hào)沒有變化，特異性下降。飽和染料在飽和濃度（熒光最大）下，也不會(huì)抑 制PCR;高濃度的染料飽和插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝，在DNA解鏈過程中就不會(huì)發(fā)生重 排，熔解曲線有更高的分辨率，飽和染料主要有LCGreen、LCGreenPlus、CYT09等。高分 辨率熔解曲線在病原菌檢測方面成本低、通量高、速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、不受檢測位點(diǎn)的局限， 實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。在病原菌檢測方面有著巨大的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種快速檢測雞白 痢沙門氏菌的PCR-HRM引物。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速檢測雞白痢沙門氏菌的PCR-HRM方法。該方 法具有操作簡單、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高且高通量、低成本的特點(diǎn)，能夠廣泛的應(yīng)用于獸 醫(yī)臨床檢測，為養(yǎng)殖廠雞白病沙門氏菌的凈化提供快速、尚效的方法。
[0007] 本發(fā)明的再一目的在于提供所述快速檢測雞白痢沙門氏菌的PCR-HRM引物的應(yīng) 用。
[0008] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種快速檢測雞白痢沙門氏菌的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下：
[0010] 上游引物rfbS-F:5^ -AAAGCAATATTCTTATGCCTA-3'或者其核苷酸的互補(bǔ)序列；
[0011] 下游引物rfbS-R:5' -CACAATTTATGAATACTGCATCHy或者其核苷酸互補(bǔ)序列。
[0012] -種快速檢測雞白痢沙門氏菌的PCR-HRM方法，包括以下步驟：
[0013] A:提取細(xì)菌DNA;
[0014] B:以DNA為模板，利用上述所述的上游引物rfbS-F、下游引物rfbS-R和飽和熒光 染料進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0015] C:對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，確定是否為雞白痢沙門氏菌。
[0016] 進(jìn)一步的，步驟B所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：
[0017]
[0018] 所述的飽和焚光染料優(yōu)選為Eva green染料。
[0019] 所述的引物rfbS-F和引物rfbS-R的濃度各優(yōu)選為lOnmol/μL;
[0020] 進(jìn)一步的，步驟Β所述的擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?br>[0021]
[0022] 進(jìn)一步的，步驟C所述的HRM分析的具體分析過程為：以雞白痢沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性 模板擴(kuò)增后的熔解溫度Tm值為參考，待測樣品熔解溫度Tm值置信值（GCP)大于95%為雞 白痢沙門氏菌。
[0023] 所述的快速檢測雞白痢沙門氏菌的PCR-HRM引物可應(yīng)用于雞白痢沙門氏菌的檢 測，養(yǎng)殖場雞白痢沙門氏菌的凈化，分子流行病學(xué)調(diào)查以及家禽養(yǎng)殖中雞白痢沙門氏菌的 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
[0024] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0025] (1)本發(fā)明首次建立了一種快速檢測雞白痢沙門氏菌的PCR-HRM引物并應(yīng)用，其 操作方便，檢測時(shí)只需要在PCR反應(yīng)中加入飽和熒光染料；簡化了臨床檢驗(yàn)的流程并且大 大縮短了檢測時(shí)間，與傳統(tǒng)國標(biāo)鑒定方法相比時(shí)間節(jié)省了 2/3 ;并且該方法具有高通量、低 成本的特點(diǎn)，一次最多可以檢驗(yàn)384個(gè)樣本。
[0026] (2)與傳統(tǒng)PCR后電泳開放操作相比，本發(fā)明從PCR過程到HRM分析實(shí)現(xiàn)了真正的 閉管操作，整個(gè)過程PCR產(chǎn)物無需再轉(zhuǎn)入其他裝置，避免了交叉污染，并且可以完成定量分 析。
[0027] (3)本發(fā)明無需特異性的探針，無需測序，使用簡便，并且檢驗(yàn)過程中不消耗PCR 產(chǎn)物，可以進(jìn)一步進(jìn)行下游分析。
[0028] (4)本發(fā)明特異性強(qiáng)，能夠很好的從腸炎沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌以及其他細(xì) 菌中區(qū)分雞白痢沙門氏菌，解決了傳統(tǒng)檢測方法鑒別雞白痢沙門氏菌準(zhǔn)確率低的問題。本 發(fā)明靈敏度高，最低檢測下限能達(dá)到34個(gè)拷貝數(shù)每微升（yL)。在雞白痢沙門氏菌的快速 診斷中展示了廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0029] 圖1是雞白痢沙門氏菌、腸炎沙門氏菌與雞傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)樣品HRM標(biāo)準(zhǔn)化熔 解曲線圖。
[0030] 圖2是雞白痢沙門氏菌、腸炎沙門氏菌與雞傷寒沙門氏菌及其他細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)樣品 HRM峰型化熔解曲線圖。
[0031]圖3是特異性檢測及雞白痢沙門氏菌臨床樣品檢測峰型化熔解曲線圖。
[0032]圖4是雞白痢沙門氏菌靈敏度檢測峰型化熔解曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0034] 實(shí)施例1引物
[0035] 根據(jù)NCBI已公布的沙門氏菌全基因組序列以及查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)雞白痢沙門氏 菌（SalmonellaPullorum)在rfbS基因上237有規(guī)律性的變化，所有雞白痢都為G，而雞傷 寒、腸炎等血清型為A，別的一些血清型和別的種類的菌株不含有該基因或者變化較大，固 可根據(jù)此位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物。
[0036] 采用01igo7引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)GeneBank發(fā)布的沙門氏菌rfbS序列（雞白 痢沙門氏菌的rfbS序列的GeneBank登錄號(hào)：LK931482 ;雞傷寒沙門氏菌的rfbS序列 的GeneBank登錄號(hào)：AF442573 ;腸炎沙門氏菌rfbS序列的GeneBank登錄號(hào)：CP007267) 以及雞白痢沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株測序獲得的rfbS序列（該rfbS序列與GeneBank登錄 號(hào)：LK931482中的相同），在rfbS基因237位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物對(duì)。上游引物rfbS-F: 5 ' -AAAGCAATATTCTTATGCCTA-3';下游引物rfbS-R:5 ' -CACAATTTATG