一組用于鼠傷寒沙門(mén)氏菌的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)的特異性引物和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一組用于鼠傷寒沙門(mén)氏菌的實(shí)時(shí) 熒光定量PCR檢測(cè)的特異性引物和探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 沙門(mén)氏菌是腸桿菌科重要的食源性致病菌之一，在我國(guó)食物中毒病例中占有較高 比率。鼠傷寒沙門(mén)氏菌（SalmonellaTyphimurium)是1982年由Loffler從鼠身上分離出 的，是最常見(jiàn)的血清型之一。鼠傷寒沙門(mén)氏菌以嬰幼兒感染最常見(jiàn)，臨床癥狀主要為發(fā)熱、 惡心、嘔吐和腹瀉。該菌為革蘭氏陰性桿菌，屬于沙門(mén)氏菌B群，不形成芽孢，無(wú)莢膜，但有 鞭毛。該菌在自然界分布廣泛，在外界環(huán)境中抵抗力較強(qiáng)，常溫下可迅速繁殖，耐低溫、干 燥，不耐熱；對(duì)酸、紫外線和各種化學(xué)消毒劑均敏感。鼠傷寒沙門(mén)氏菌因其耐藥性能強(qiáng)、傳播 途徑廣、侵染宿主多等特點(diǎn)，被廣泛關(guān)注。研究表明，鼠傷寒沙門(mén)氏菌具有極強(qiáng)的多重耐藥 性，對(duì)多數(shù)抗生素均表現(xiàn)出抵抗能力。
[0003]目前生化鑒定與血清分型是鑒定鼠傷寒沙門(mén)氏菌最主要方法。此方法需經(jīng)過(guò)增 菌培養(yǎng)、選擇篩選、生化鑒定、血清分型等流程，耗時(shí)一周左右，不利于快速、準(zhǔn)確的對(duì)鼠傷 寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)。用免疫酶試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散法、乳膠凝集試驗(yàn)和免疫熒光法及酶聯(lián)免 疫吸附試驗(yàn)等方法檢測(cè)沙門(mén)氏菌的結(jié)果尚不理想。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Fluorescence quantitativePCR)技術(shù)從常規(guī)PCR定性檢測(cè)邁上量化的臺(tái)階，實(shí)現(xiàn)了PCR 技術(shù)從定性到定量的飛躍，避免了傳統(tǒng)PCR定量鑒定中交叉污染的問(wèn)題，它相對(duì)常規(guī)PCR技 術(shù)先進(jìn)、操作簡(jiǎn)便，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、絕對(duì)定量和快速檢測(cè)的目的，同時(shí)具有靈敏度高、特異 性好、操作便捷等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)一組用于用于定量測(cè)定鼠傷寒沙門(mén)氏菌含量的特異性引 物和探針序列，建立一種能廣泛應(yīng)用于鼠傷寒沙門(mén)氏菌檢測(cè)的快速、靈敏、特異性好的熒光 定量PCR檢測(cè)的方法。本發(fā)明采用基因克隆技術(shù)，將鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM4493基因片段插 入到載體PMD18-T中，獲得含有STM4493基因片段的重組質(zhì)粒，以此作為標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)鼠 傷寒沙門(mén)氏菌STM4493的基因片段編碼基因序列設(shè)計(jì)并合成一組特異性引物和探針，優(yōu)化 PCR反應(yīng)條件，建立以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)為平臺(tái)的檢測(cè)方法，并對(duì)所建立的方法進(jìn) 行評(píng)估。
[0005] 本發(fā)明提供一組用于鼠傷寒沙門(mén)氏菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的特異性引物和 探針，所述特異性引物和探針的核苷酸序列為（1)_(3)中的一種： (1)、上游引物：5' -CAGAATGATGCTGAAGTTGAACAA-3' ； 下游引物：5'_GCGTGCGGCGATGTTAGIT-3' ； 探針：5' -CTTACGGCAGTGGAGCCAGCATCT-3' ； 所述引物和探針擴(kuò)增的目標(biāo)核苷酸序列參見(jiàn)序列表中SEQIDNo. 2; (2) 、與（1)所述序列互補(bǔ)的序列； (3) 、將（1)中所述序列向5'端和3'端方向延伸一至數(shù)個(gè)堿基或刪減一至數(shù)個(gè)堿基得 到的序列。
[0006] 經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，將（1)中所述序列向5'端和3'端方向延伸一至數(shù)個(gè)堿基或刪減一 至數(shù)個(gè)堿基得到的引物序列也能很好的擴(kuò)增上述目標(biāo)核苷酸序列。
[0007] 作為優(yōu)選方案，所述探針的5'端熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM、TET、J0E、HEX或VIC，3'端 標(biāo)記的是熒光淬滅基團(tuán)TAMRA、DABCYL或BHQ。
[0008] 本發(fā)明還提供鼠傷寒沙門(mén)氏菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括 權(quán)利要求1所述的引物和探針。
[0009] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述特異性引物和探針、試劑盒在定量檢測(cè)鼠傷寒沙 門(mén)氏菌含量中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供鼠傷寒沙門(mén)氏菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，步驟 如下： (1)制備標(biāo)準(zhǔn)品：將鼠傷寒沙門(mén)氏菌保守基因片段插入到載體PMD18-T中，獲得含有鼠 傷寒沙門(mén)氏菌保守基因片段的重組質(zhì)粒，以此作為標(biāo)準(zhǔn)品；所述鼠傷寒沙門(mén)氏菌保守基因 片段參見(jiàn)序列表中SEQIDNo. 1的第447-822位核苷酸序列； (2 )標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制； (3) 使用權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針對(duì)待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品采用相同的反應(yīng)體 系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增； (4) 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品的Ct值進(jìn)行鼠傷寒沙門(mén)氏菌的快速定量檢測(cè)。
[0011] 作為優(yōu)選方案，所述鼠傷寒沙門(mén)氏菌保守基因片段是通過(guò)以下引物擴(kuò)增得到的： 上游引物為 5'-GCCGCACITTGGAATGTTAT-3' ； 下游引物為 5'-TCACAATCCCAITTCAITCCAG-3'。
[0012] 作為又一優(yōu)選方案，步驟（3)中所述引物和探針的用量均為1.6yl。
[0013] 作為又一優(yōu)選方案，步驟（3)中所述實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變 性2分鐘，94°C15秒、60°C40s并收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。
[0014] 本發(fā)明提供用于對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行定性、定量檢測(cè)的引物和探針，通過(guò)提取 待檢測(cè)樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄得到的CDNA，也可以通過(guò)提取鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因組DNA，結(jié)合 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，可達(dá)到準(zhǔn)確定量檢測(cè)標(biāo)本中鼠傷寒沙門(mén)氏菌含量的目的。本 發(fā)明所提供的引物和探針可對(duì)食品中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌含量進(jìn)行定性、定量分析，對(duì)判斷 食品中鼠傷寒沙門(mén)氏菌的含量具有重要意義，本發(fā)明將在食品檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。應(yīng) 用本發(fā)明的引物和探針能夠快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異性好的定量檢測(cè)待測(cè)樣本中鼠傷寒沙門(mén) 氏菌的含量。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為引物和探針體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中，a代表引物為1. 6ii1，探針為I. 6iiI;b 代表引物為l.Oy1，探針為1.6yI;c代表引物為L(zhǎng)Oy1，探針為0. 8yI;d代表引物為 2. 0y1，探針為0. 8yI;e代表引物為I. 6y1，探針為0. 8yI;f代表引物為2. 0y1，探針為 l.〇yI;g代表引物為l.〇y1，探針為〇. 8yI;h代表引物為L(zhǎng)Oy1，探針為1.0yI;i代 表引物為2. 0y1，探針為I. 6y1 ; 圖2為靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中，a代表質(zhì)粒濃度分別為I.OOX108coPies/ml、b代表 質(zhì)粒濃度為l.〇〇X107copies/ml、c代表質(zhì)粒濃度為1.00X106copies/ml、d代表質(zhì)粒濃 度為1.00X105COpies/ml、e代表質(zhì)粒濃度為1.00X104COpies/ml、f代表質(zhì)粒濃度為 I.OOX103copies/ml、g代表質(zhì)粒濃度為I.OOX102copies/ml和陰性對(duì)照； 圖3為特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線的為鼠傷寒沙門(mén)氏菌質(zhì)粒，未出現(xiàn)標(biāo) 準(zhǔn)擴(kuò)增曲線的甲型副傷寒沙門(mén)氏菌、乙型副傷寒沙門(mén)氏菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌、大腸埃希菌、 奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、乙 型溶血性鏈球菌、福氏志賀菌、腦膜炎奈瑟菌、幽門(mén)螺旋桿菌、陰性對(duì)照； 圖4為鼠傷寒沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。所用引物、探針和所用序列測(cè)定工作均由生工生物工 程(上海）股份有限公司合成和完成。
[0017] 實(shí)施例ISTM4493基因標(biāo)準(zhǔn)品的制備 要建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，首先必須制備方法所需的外部標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)包含 高度保守、特異的序列，要保證反應(yīng)的高特異性。STM4493基因具有很高的保守性。本研究 采用鼠傷寒沙門(mén)氏菌STM4493基因作為靶序列。本實(shí)施例主要采用PCR技術(shù)擴(kuò)增鼠傷寒沙 門(mén)氏菌的STM4493基因，利用基因重組技術(shù)將其連接到質(zhì)粒載體pMD18-T中，構(gòu)建出重組質(zhì) 粒PMD18-T-STM4493,并進(jìn)行相應(yīng)的PCR鑒定和測(cè)序鑒定，最后經(jīng)定量作為待建立方法的標(biāo) 準(zhǔn)品，為下一步的方法及評(píng)估奠定基礎(chǔ)。
[0018] -、模板DNA的制備 提取鼠傷寒沙門(mén)氏菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株）基因組DNA，用作STM4493基因PCR擴(kuò)增的模板： (1) 取Iml菌懸液，8000r/min離心5分鐘，棄上清液； (2) 加入10%蔗糖的TE緩沖液400y1懸浮菌液沉淀，混勻后加入20mg/ml的溶菌酶 20y1，37°C作用 45min; (3) 加入30yl10%SDS和 3yl10mg/ml蛋白酶K，55°C水浴lh; (4) 加入500y1的酸/氯仿/異戊醇(體積比25:24:1)混勾，12000r/min離心IOmin; (5) 取上清，加入500y1的氯仿/異戊醇(體積比24:1)混勾，12000r/min離心IOmin; (6)