一種利用issr分子標(biāo)記檢測(cè)花生種子純度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]—種利用ISSR分子標(biāo)記檢測(cè)花生種子純度的方法屬于花生種子純度鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是利用ISSR分子標(biāo)記檢測(cè)花生種子純度技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]花生是我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，我國(guó)年均種植花生7000多萬(wàn)畝，年需要花生種子160萬(wàn)噸，花生用種量大，不同品種間種子差異性較小，單純從植株和莢果等外部性狀很難區(qū)分品種間的差異，導(dǎo)致我國(guó)花生種子市場(chǎng)混亂，種子純度很低，很多種業(yè)公司甚至出現(xiàn)張冠李戴現(xiàn)象，一個(gè)品種的種子當(dāng)成多個(gè)品種的種子來(lái)售賣。急需要一種方便快捷準(zhǔn)確的花生種子純度鑒定方法。
[0003]簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增(ISSR)是一種在簡(jiǎn)單重復(fù)序(SSR)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型的分子標(biāo)記。該技術(shù)以錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，在SSR序列的3’或5’端加錨2.4個(gè)隨機(jī)核苷酸，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可以引起特定位點(diǎn)退火，導(dǎo)致與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片斷進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所擴(kuò)增的Inter.SSR區(qū)域的多個(gè)條帶可通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳或者瓊脂糖凝膠電泳得以分辨。它結(jié)合RAPD標(biāo)記技術(shù)冪HSSR標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，能夠提供更多的基因組DNA信息。現(xiàn)己廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定、進(jìn)化與親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性與居群遺傳結(jié)構(gòu)檢測(cè)、遺傳作圖、基因定位、分子標(biāo)記輔助育種等方面的研究。ISSR標(biāo)記技術(shù)試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快速、高效，不需要繁瑣的構(gòu)建基因文庫(kù)、雜交和同位素顯示等步驟；重復(fù)序列和錨定堿基的選擇是隨機(jī)的，無(wú)需知道任何靶標(biāo)序列的SSR背景信息，從而降低了技術(shù)難度和實(shí)驗(yàn)成本；無(wú)需活材料，無(wú)組織器官特異性，能實(shí)現(xiàn)全基因組無(wú)編碼取樣:采用了較長(zhǎng)的引物(17。24bp)，退火溫度較高，因此，引物具有更強(qiáng)的專一性，增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]解決花生種子鑒定困難且不準(zhǔn)確的難題，本發(fā)明利用ISSR分子標(biāo)記鑒定花生純度。
[0005]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
通過(guò) 4 條 ISSR 引物 WLS1:AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC ；WLS2:CAT GGT GTT GGT CATTGT TCC A ；WLS3:AGA GAG AGA GAG AGA GYC 和 WLS4:AGA GAG AGA GAG AGA GCL 來(lái)鑒別花生種子的純度。鑒別種子純度的ISSR-PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系(20 μ 1)為1.4U Taq DNA聚合酶，0.35mmol/L dNTP，0.7 μ mol/L 引物，25ng 模板 DNA, 1.75mmol/L MgC12，lOxPCRBuffer 2.Ομ?，加ddH20至25μ1。鑒別種子純度的ISSR-PCR反應(yīng)條件為:在PCR儀中預(yù)變性94°C 120秒，然后循環(huán):94°C 50秒，70°C 30秒，72°C 130秒，共38輪循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，72°C 15分鐘，4°C保存。電泳結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物15ul加3ul上樣緩沖液(6x)于1.6%或1.8%瓊脂糖膠上電泳，穩(wěn)壓50-100V(電壓低帶型整齊，分辨率高)；電泳結(jié)束，溴化乙錠染色20分鐘，用凝膠成像儀觀察、拍照，觀察電泳條帶數(shù)和位置來(lái)鑒別花生種子純度。如果樣品電泳條帶數(shù)一樣多而且位置相同，則表明是同一個(gè)品種。
[0006]本發(fā)明的有益效果是利用ISSR分子標(biāo)記鑒定花生種子純度，可以有效防止假雜種摻入，不僅可以使種子播后苗情一致，充分發(fā)揮良種的增產(chǎn)潛力，作物生長(zhǎng)整齊，成熟期一致，有利于機(jī)械化作業(yè)。
【具體實(shí)施方式】
[0007]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，實(shí)施例僅為對(duì)
【發(fā)明內(nèi)容】
的詳細(xì)說(shuō)明，并不用于限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下，對(duì)本發(fā)明專利內(nèi)容的修改，都將等價(jià)落在本發(fā)明專利的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0008]實(shí)施例1
隨機(jī)抽取大花生新品種花育33號(hào)的種子樣品100份，通過(guò)4條ISSR引物WLS1:AGA GTTGGT AGC TCT TGA TC ；WLS2:CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCC A ；WLS3:AGA GAG AGA GAG AGAGYC和WLS4:AGA GAG AGA GAG AGA GCL來(lái)鑒別種子的純度。鑒別種子純度的ISSR-PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系(20 μ 1)為 1.4U Taq DNA 聚合酶，0.35mmol/L dNTP，0.7 μ mol/L 引物，25ng模板 DNA，1.75mmol/L MgC12，lOxPCR Buffer 2.0 μ 1，加 ddH20 至 25 μ 1。鑒別種子純度的ISSR-PCR反應(yīng)條件為:在PCR儀中預(yù)變性94°C 120秒，然后循環(huán):94°C 50秒，70°C 30秒，72°C 130秒，共38輪循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，72°C 15分鐘，4°C保存。電泳結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物15ul加3ul上樣緩沖液^x)于1.6%瓊脂糖膠上電泳，穩(wěn)壓50-100V(電壓低帶型整齊，分辨率高)；電泳結(jié)束，溴化乙錠染色20分鐘，用凝膠成像儀觀察、拍照，觀察電泳條帶數(shù)和位置來(lái)鑒別花生種子純度?；ㄓ?3號(hào)100份樣品中，WLS1引物條帶位置和數(shù)目完全相同，WLS2引物只有1個(gè)樣品條帶位置不同，WLS3引物1個(gè)樣品條帶數(shù)目不同，WLS4引物1個(gè)樣品條帶位置和數(shù)目不相同。檢測(cè)結(jié)果表明花育33號(hào)花生新品種種子純度在98%以上。
[0009]實(shí)施例2
隨機(jī)抽取小花生新品種花育20號(hào)的種子樣品100份，通過(guò)4條ISSR引物WLS1:AGA GTTGGT AGC TCT TGA TC ；WLS2:CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCC A ；WLS3:AGA GAG AGA GAG AGAGYC和WLS4:AGA GAG AGA GAG AGA GCL來(lái)鑒別種子的純度。鑒別種子純度的ISSR-PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系(20 μ 1)為 1.4U Taq DNA 聚合酶，0.35mmol/L dNTP，0.7 μ mol/L 引物，25ng模板 DNA，1.75mmol/L MgC12，lOxPCR Buffer 2.0 μ 1，加 ddH20 至 25 μ 1。鑒別種子純度的ISSR-PCR反應(yīng)條件為:在PCR儀中預(yù)變性94°C 120秒，然后循環(huán):94°C 50秒，70°C 30秒，72°C 130秒，共38輪循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，72°C 15分鐘，4°C保存。電泳結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物15ul加3ul上樣緩沖液^x)于1.8%瓊脂糖膠上電泳，穩(wěn)壓50-100V(電壓低帶型整齊，分辨率高)；電泳結(jié)束，溴化乙錠染色20分鐘，用凝膠成像儀觀察、拍照，觀察電泳條帶數(shù)和位置來(lái)鑒別花生種子純度?；ㄓ?0號(hào)100份樣品中，WLS1引物條帶位置和數(shù)目完全相同的有96份，WLS2引物有5個(gè)樣品條帶位置不同，WLS3引物3個(gè)樣品條帶數(shù)目不同，WLS4引物3個(gè)樣品條帶位置和數(shù)目不相同。檢測(cè)結(jié)果表明花育20號(hào)花生新品種種子純度在95%以上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用ISSR分子標(biāo)記檢測(cè)花生種子純度的方法，其特征在于它通過(guò)4條ISSR引物 WLSI:AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC ；WLS2:CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCC A ；WLS3:AGAGAG AGA GAG AGA GYC 和 WLS4:AGA GAG AGA GAG AGA GCL 來(lái)鑒別花生種子的純度。2.鑒別種子純度的ISSR-PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系(20μ I)為1.4U Taq DNA聚合酶，0.35mmol/L dNTP，0.7 ymol/L 引物，25ng 模板 DNA, 1.75mmol/L MgCl2, 1xPCR Buffer2.0 μ 1，加 ddH20 至 25 μ L.3.鑒別種子純度的ISSR-PCR反應(yīng)條件為:在PCR儀中預(yù)變性94°C120秒，然后循環(huán):94°C 50秒，70°C 30秒，72°C 130秒，共38輪循；循環(huán)結(jié)束后，72°C 15分鐘，4°C保存。4.電泳鑒定，取PCR產(chǎn)物15ul加3ul上樣緩沖液(6x)于1.6%或1.8%瓊脂糖膠上電泳，穩(wěn)壓50-100V(電壓低帶型整齊，分辨率高)；電泳結(jié)束，溴化乙錠染色20分鐘，用凝膠成像儀觀察、拍照，觀察電泳條帶數(shù)和位置來(lái)鑒別花生種子純度。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用ISSR分子標(biāo)記檢測(cè)花生種子純度的方法，它通過(guò)4條ISSR引物WLS1：AGA？GTT？GGT？AGC？TCT？TGA？TC；WLS2：CAT？GGT？GTT？GGT？CAT？TGT？TCC？A；WLS3：AGA？GAG？AGA？GAG？AGA？GYC和WLS4：AGA？GAG？AGA？GAG？AGA？GCL來(lái)鑒別花生種子的純度。鑒別種子純度的ISSR-PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系(20μl)為1.4U？Taq？DNA聚合酶，0.35mmol/L？dNTP，0.7μmol/L引物，25ng模板DNA，1.75mmol/L？MgCl2，10xPCR？Buffer？2.0μl，加ddH2O至25μl。利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以快速鑒別花生種子的純度，充分發(fā)揮花生新品種增產(chǎn)的潛力，增加種植戶的積極性。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105256016
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510646566
【發(fā)明人】鄭輝, 王玉春, 黃翔
【申請(qǐng)人】山東臥龍種業(yè)有限責(zé)任公司
【公開日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年10月9日