本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說是涉及一種牙齒標(biāo)本消毒方法。
背景技術(shù)：
：牙髓干細(xì)胞(dentalpulpstemcells,DPSCs)是存在于牙齒牙髓組織中的一類具有自我更新、增殖能力強(qiáng)，及多向分化能力的間充質(zhì)干細(xì)胞。牙髓干細(xì)胞具有多向分化的潛能，它除了能形成礦化結(jié)節(jié)能力的細(xì)胞外，經(jīng)過不同細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，還能夠分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、血管內(nèi)皮、肝、神經(jīng)等細(xì)胞系類型。成功從離體的牙齒中提取出足夠量符合標(biāo)準(zhǔn)的牙髓干細(xì)胞，首先遇到的問題就是離體牙齒消毒的問題?？谇画h(huán)境較其他組織環(huán)境不同，口腔內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量很多，種類相當(dāng)繁雜，離體牙齒消毒方式不當(dāng)極易發(fā)生染菌，且牙齒內(nèi)細(xì)胞量較少，離體牙齒消毒方式不當(dāng)也極易發(fā)生牙髓干細(xì)晌提取失敗的情況。文獻(xiàn)《人乳牙牙髓干細(xì)胞的體外培養(yǎng)觀察》(陸家瑜等，口腔頜面外科雜志，2007年3月第17卷第1期)中公開了從人乳牙中分離牙髓干細(xì)胞的研究內(nèi)容，其中涉及到消毒措施：收集7-8歲兒童因滯留而拔出的乳切牙，拔出前徹底消毒，拔出后立即放入預(yù)冷的含高倍雙抗的DMEM不完全培養(yǎng)基中，從預(yù)冷的培養(yǎng)液中取出牙齒,乙醇消毒牙面,用含雙抗的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline,PBS)反復(fù)沖洗。但是由于研究的重點(diǎn)是牙髓干細(xì)胞體外培養(yǎng)，故該文獻(xiàn)并未記載此消毒措施的效果。中國專利CN104705289A公開了一種離體牙齒保存液，每升保存液中有以下組分：青霉素0.3-0.6g、鏈霉素0.5-1g、甲硝唑0.02-0.04g、兩性霉素B0.015-0.025g、羥甲基纖維素5-10g、胰島素50-100μg，余量為MEM。該保存液能夠有效保持牙髓干細(xì)胞的活性，并在一定程度上降低細(xì)菌污染。雖然上述兩個(gè)專利公開的技術(shù)內(nèi)容在對牙齒標(biāo)本消毒上可能有一定的幫助，但是經(jīng)過實(shí)際的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，其消毒效果以及消毒后牙髓干細(xì)胞活性并不理想。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種牙齒標(biāo)本消毒方法，使得所述消毒方法能夠避免牙齒染菌情況，并保證提取的牙髓干細(xì)胞活性較高，不受明顯影響。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種牙齒標(biāo)本消毒方法，包括：步驟1、將拔出的牙齒標(biāo)本放入預(yù)冷的保存液中；步驟2、從保存液中取出牙齒標(biāo)本消毒；步驟3、剔除牙齒表面的牙周膜組織，重復(fù)步驟2的消毒措施；步驟4、將牙齒標(biāo)本放置在保存液中清洗；其中，所述保存液包括：氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、青霉素、鏈霉素和兩性霉素B。針對現(xiàn)有的消毒方法在消毒效果以及消毒后牙髓干細(xì)胞活性上不佳的問題，本發(fā)明在消毒的過程中加入了牙齒標(biāo)本保存液進(jìn)行消毒，同時(shí)在剔除牙周膜組織后再次進(jìn)行一次消毒，最終在兩個(gè)方面都取得了較好地效果。其中，所述保存液在具體實(shí)施過程中各組分濃度為：氯化鈉8g/L、氯化鉀0.2g/L、磷酸氫二鈉1.44g/L、磷酸二氫鉀0.24g/L、青霉素50U-500U/mL、鏈霉素50μg-500μg/mL和兩性霉素B0.5μg-5μg/mL，pH值7.2。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述青霉素濃度為100U/mL，所述鏈霉素濃度為100μg/mL，所述兩性霉素B濃度為1μg/mL。同時(shí)，本發(fā)明還提供了所述保存液的制備方法，配制氯化鈉8g/L、氯化鉀0.2g/L、磷酸氫二鈉1.44g/L、磷酸二氫鉀0.24g/L的混合溶液，調(diào)pH值為7.2，滅菌后加入青霉素、鏈霉素以及兩性霉素B，使其終濃度分別為500U-50U/mL、500μg-50μg/mL、5μg-0.5μg/mL。在實(shí)際配制過程中，可以定容到1L來進(jìn)行配制。作為優(yōu)選，步驟2具體為從保存液中取出牙齒標(biāo)本消毒進(jìn)行碘伏消毒或乙醇消毒。更具體地，步驟2為：用無菌鑷子取出牙齒標(biāo)本放入75％乙醇中，如果牙齒完整，無缺損，將牙齒完全浸沒于消毒液中3-5min；如果牙齒缺損且暴露牙髓組織，將牙髓暴露缺口朝上，其他部分浸泡于消毒液中3-5min，用無菌紗布浸潤75％乙醇擦拭牙髓暴露處30-60秒。作為優(yōu)選，所述預(yù)冷為預(yù)先在2-8℃下冷藏。作為優(yōu)選，步驟1中將拔出的牙齒標(biāo)本放入預(yù)冷的保存液中10min-48h。本發(fā)明將CN104705289A中公開的保存液替換本發(fā)明保存液進(jìn)行消毒作為對照，同時(shí)以文獻(xiàn)《人乳牙牙髓干細(xì)胞的體外培養(yǎng)觀察》作為另一個(gè)對照，進(jìn)行牙齒消毒效果和牙髓干細(xì)胞活性的檢測。結(jié)果顯示，本發(fā)明所述消毒方法能夠避免牙齒標(biāo)本染菌情況的出現(xiàn)，同時(shí)消毒后牙齒提取的牙髓干細(xì)胞的活性也較高，而兩個(gè)對照組均出現(xiàn)了牙齒染菌情況，并且牙髓干細(xì)胞的活性也高低不一。由以上技術(shù)效果可知，本發(fā)明在消毒的過程中加入了牙齒標(biāo)本保存液進(jìn)行消毒，同時(shí)在剔除牙周膜組織后再次進(jìn)行一次消毒，消毒后的牙齒標(biāo)本能夠避免染菌情況的出現(xiàn)，同時(shí)所提取的牙髓干細(xì)胞仍然保持較高的活性，未受到明顯影響。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施例公開了一種牙齒標(biāo)本消毒方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的一種牙齒標(biāo)本消毒方法進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1：本發(fā)明所述消毒方法1、配制本發(fā)明所述保存液8g氯化鈉(NaCl)，0.2g氯化鉀(KCl)、1.44g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，0.24g磷酸二氫鉀(KH2PO4)，調(diào)pH7.2，定容1L；然后高壓蒸汽滅菌，取10mL溶液加入青霉素，使其終濃度為100U/mL，加入鏈霉素使其終濃度為100μg/mL,加入兩性霉素B，使其終濃度為1μg/ml，放置4℃?zhèn)溆谩?、本發(fā)明消毒方法在牙齒標(biāo)本采集后，放入經(jīng)過消毒的裝有預(yù)冷保存液的容器中10min-48h(根據(jù)運(yùn)送標(biāo)本時(shí)間而具體調(diào)整)。然后用無菌鑷子取出牙齒標(biāo)本放入75％乙醇中，如果牙齒完整，無缺損，將牙齒完全浸沒于消毒液中3-5min；如果牙齒缺損且暴露牙髓組織，將牙髓暴露缺口朝上，其他部分浸泡于消毒液中3-5min，用無菌紗布浸潤75％乙醇擦拭牙髓暴露處30-60秒。取出牙齒，置于無菌平皿中，在用無菌鋒利刀片去除牙齒表面的牙周膜組織，將牙齒表面剔除干凈后，再放置含有75％的乙醇中浸泡3-5min。如果牙齒完整，無缺損，將牙齒完全浸沒于消毒液中3-5min；如果牙齒缺損且暴露牙髓組織，將牙髓暴露缺口朝上，其他部分浸泡于消毒液中3-5min，用無菌紗布浸潤75％乙醇擦拭牙髓暴露處30-60秒。經(jīng)過乙醇消毒后，將牙齒放置在保存液中清洗牙齒，去除乙醇。實(shí)施例2：本發(fā)明所述消毒方法1、配制本發(fā)明所述保存液8g氯化鈉(NaCl)，0.2g氯化鉀(KCl)、1.44g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，0.24g磷酸二氫鉀(KH2PO4)，調(diào)pH7.2，定容1L；然后高壓蒸汽滅菌，取10mL溶液加入青霉素，使其終濃度為50U/mL，加入鏈霉素使其終濃度為500μg/mL,加入兩性霉素B，使其終濃度為0.5μg/ml，放置4℃?zhèn)溆谩?、本發(fā)明消毒方法在牙齒標(biāo)本采集后，放入經(jīng)過消毒的裝有預(yù)冷保存液的容器中10min-48h(根據(jù)運(yùn)送標(biāo)本時(shí)間而具體調(diào)整)。然后用無菌鑷子取出牙齒標(biāo)本放入碘伏消毒液中，如果牙齒完整，無缺損，將牙齒完全浸沒于消毒液中3-5min；如果牙齒缺損且暴露牙髓組織，將牙髓暴露缺口朝上，其他部分浸泡于消毒液中3-5min，用無菌紗布浸潤75％乙醇擦拭牙髓暴露處30-60秒。取出牙齒，置于無菌平皿中，在用無菌鋒利刀片去除牙齒表面的牙周膜組織，將牙齒表面剔除干凈后，再放置含有碘伏消毒液中浸泡3-5min。如果牙齒完整，無缺損，將牙齒完全浸沒于消毒液中3-5min；如果牙齒缺損且暴露牙髓組織，將牙髓暴露缺口朝上，其他部分浸泡于消毒液中3-5min，用無菌紗布浸潤75％乙醇擦拭牙髓暴露處30-60秒。經(jīng)過碘伏消毒液消毒后，將牙齒放置在保存液中清洗牙齒，去除碘伏消毒液。實(shí)施例3：本發(fā)明所述消毒方法1、配制本發(fā)明所述保存液8g氯化鈉(NaCl)，0.2g氯化鉀(KCl)、1.44g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，0.24g磷酸二氫鉀(KH2PO4)，調(diào)pH7.2，定容1L；然后高壓蒸汽滅菌，取10mL溶液加入青霉素，使其終濃度為500U/mL，加入鏈霉素使其終濃度為50μg/mL,加入兩性霉素B，使其終濃度為5μg/ml，放置4℃?zhèn)溆谩?、本發(fā)明消毒方法在牙齒標(biāo)本采集后，放入經(jīng)過消毒的裝有預(yù)冷保存液的容器中10min-48h(根據(jù)運(yùn)送標(biāo)本時(shí)間而具體調(diào)整)。然后用無菌鑷子取出牙齒標(biāo)本放碘伏消毒液中，如果牙齒完整，無缺損，將牙齒完全浸沒于消毒液中3-5min；如果牙齒缺損且暴露牙髓組織，將牙髓暴露缺口朝上，其他部分浸泡于消毒液中3-5min，用無菌紗布浸潤75％乙醇擦拭牙髓暴露處30-60秒。取出牙齒，置于無菌平皿中，在用無菌鋒利刀片去除牙齒表面的牙周膜組織，將牙齒表面剔除干凈后，再放置含有75％的乙醇中浸泡3-5min。如果牙齒完整，無缺損，將牙齒完全浸沒于消毒液中3-5min；如果牙齒缺損且暴露牙髓組織，將牙髓暴露缺口朝上，其他部分浸泡于消毒液中3-5min，用無菌紗布浸潤75％乙醇擦拭牙髓暴露處30-60秒。經(jīng)過乙醇消毒后，將牙齒放置在保存液中清洗牙齒，去除乙醇。實(shí)施例4：消毒方法的對比1、對照對照方法1：文獻(xiàn)《人乳牙牙髓干細(xì)胞的體外培養(yǎng)觀察》中涉及到消毒措施：收集7-8歲兒童因滯留而拔出的乳切牙，拔出前徹底消毒，拔出后立即放入預(yù)冷的含高倍雙抗的DMEM不完全培養(yǎng)基中，從預(yù)冷的培養(yǎng)液中取出牙齒,乙醇消毒牙面,用含雙抗的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline,PBS)反復(fù)沖洗。對照方法2：用專利CN104705289A實(shí)施例1保存液替換本發(fā)明保存液，其余按照實(shí)施例1中的消毒方法進(jìn)行。2、牙髓干細(xì)胞提取方法及活性檢測將消毒后的牙齒用PBS清洗2次。再用鉗子鉗開牙齒，組織鑷取出牙髓。放置在0.3％I型膠原酶+0.4％分散酶消化30-60min后，以1200rpm離心10min中，用PBS清洗一次后，過100μm細(xì)胞篩，再次以1200rpm離心5min。用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素、1μg/ml兩性霉素B的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到25ml培養(yǎng)瓶中，在37℃，5％CO2培養(yǎng)，每2天換液一次，當(dāng)細(xì)胞待細(xì)胞達(dá)到匯合點(diǎn)(即細(xì)胞長滿瓶底的70％-80％)時(shí)，用2.5g/L胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代，按1:3傳代，第5代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活力檢測。4、牙齒染菌試驗(yàn)將20顆離體健康牙齒按照各方法消毒后，放置裝有LB培養(yǎng)液(10mg/mL胰蛋白胨(tryptone),5mg/mL酵母提取物(yeastextract),10mg/mL氯化鈉(NaCl))的試管中，37℃200rpm搖晃過夜，用接種環(huán)接種50μL少量液體接種徒步LB平皿，放置37攝氏度培養(yǎng)箱5天，觀察是否有細(xì)菌菌落形成。5、試驗(yàn)結(jié)果見表1。表1牙齒染菌試驗(yàn)結(jié)果及牙髓干細(xì)胞活性形成細(xì)菌菌落的牙齒數(shù)量無細(xì)菌菌落的牙齒數(shù)量牙髓干細(xì)胞活性實(shí)施例102090％實(shí)施例202085％實(shí)施例302087％對照161489％對照251583％由上表可知，本發(fā)明消毒方法可以完全避免牙齒染菌現(xiàn)象的出現(xiàn)，而對照的兩個(gè)方法均出現(xiàn)染菌情況，且本發(fā)明得到的牙髓干細(xì)胞活力均大于85％。以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3