豌豆抗白粉病er1等位基因er1-7及與基因er1-7連鎖的分子標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物病理學(xué)、遺傳育種及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及豌豆抗白粉 病erl新等位基因 erl-7及與基因 erl-7連鎖的分子標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002] 豌豆（Pisum sativum L.)是世界上重要的豆類作物。由白粉菌（Erysiphe pisi D. C.)引起的豌豆白粉病是世界性的重要病害，該病在溫帶及亞熱帶地區(qū)普遍發(fā)生，特別是 在白天溫暖、夜間寒冷的氣候條件下危害嚴(yán)重，造成25%~50%產(chǎn)量損失，嚴(yán)重感染的豌 豆品種損失可達(dá) 80% 以上（Nisar et al.，2011;Fondevilla et al.，2012)〇
[0003] 防治豌豆白粉病最為經(jīng)濟(jì)、有效且環(huán)境安全的方法是種植抗病品種。目前，國外 已經(jīng)鑒定了大量的抗白粉病豌豆資源，并在抗性資源中鑒定了 3個獨立遺傳的抗白粉病基 因，包括2個隱性基因61'1〇^1'1&11(16七31.，1948)和612(}161'；[1^3 6七31.，1969)以及1 個顯性基因 Er3(Fondevilla et al.，2007)。erl基因的抗性機(jī)制是抑制病原菌對寄主表 皮細(xì)胞的侵入，表現(xiàn)高抗或免疫，抗性不受環(huán)境條件的影響，具有廣譜、持久抗性，已在歐 洲、北美洲及澳大利亞的豌豆育種中廣泛應(yīng)用（Fondevilla et al.，2006)。er2的抗性機(jī) 制是在病原菌入侵通過寄主細(xì)胞的死亡而限制白粉菌的發(fā)展，只在葉片上表現(xiàn)抗性，且抗 性受溫度、葉齡等多種因素的影響，在多數(shù)情況下表現(xiàn)為感病，這限制了其在育種中的應(yīng)用 (Fondevilla et al.，2006)。Er3是最近在豌豆野生種P.fulvum中發(fā)現(xiàn)的，其應(yīng)用價值有 待進(jìn)一步研究（Fondevilla et al.，2007) 0
[0004] 迄今，除在豌豆資源JI 2480中鑒定豌豆抗白粉病基因 er2和在豌豆野生種 P. fulvum中鑒定Er3外，大量抗性資源篩選和遺傳分析方面的研究表明，許多不同地 理起源的抗白粉病豌豆資源的抗性均由erl控制（Tiwari et al·，1997a ;Ghafoor et al.，2012 ;Liu et al.，2003 ;Vaid et al.，1997)。因此，目前生產(chǎn)中應(yīng)用的抗白粉病豌豆 資源的抗性均由erl控制。隨著豌豆分子標(biāo)記的開發(fā)和遺傳圖譜的構(gòu)建，抗病基因 erl和 er2分別被定位在豌豆遺傳圖譜的第6連鎖群（LG VI) (Timmerman et al.，1994)和第3 連鎖群（LG III) (Katoch et al.，2010)上，而基因 Er3在豌豆遺傳圖譜上的位置還不確定 (Fondevilla et al. , 2007)〇
[0005] 最近，Humphry等（2011)和Pavan等（2011)研究發(fā)現(xiàn)，豌豆抗白粉病基因 erl 是由與大麥感白粉病基因（MLO)序列同源PsMLO功能喪失而產(chǎn)生的。在自然條件下，豌 豆PsMLO同源序列發(fā)生堿基缺失、插入、替換等導(dǎo)致不同的erl等位基因產(chǎn)生，如Mexique 4、Stratagem、JI 210和JI 1951因突變的位置與方式不同導(dǎo)致不同的erl等位基因產(chǎn) 生，即 erl_l、erl_2、erl_3 和 erl_4(Humphry et al.，2011)。通過化學(xué)誘變劑處理豌豆 感白粉病感病品種獲得了 erl另一個等位基因 erl-5 (Pereira et al.，2010 !Humphry et al. ,2011)。最近，Sun et al (2015b)在中國豌豆地方品種中鑒定了 erl新等位基因 erl-6。
[0006] 我國對豌豆抗性研究較少，目前研究主要集中在豌豆抗白粉病的資源篩選，已經(jīng) 鑒定了一些抗白粉病資源。最近，王仲怡等（2013)和付海寧等（2014)在控制培養(yǎng)條件下， 篩選出了許多免疫資源。在這些豌豆抗病資源中鑒定了抗病erl等位基因 erl-1、erl-2、 erl-6 (Sun et al·，2015a，2015b;王仲怡等，2015)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供豌豆抗白粉病erl新等位基因 erl-7及其編碼蛋白。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供與豌豆抗白粉病等位基因 erl-7連鎖的分子標(biāo)記。
[0009] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的erl-7蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No. 1所 示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0010] 本發(fā)明還提供編碼所述蛋白的豌豆抗白粉病erl等位基因 erl-7,其cDNA序列如 Seq ID No. 2 所示。
[0011] 本發(fā)明還提供與豌豆抗白粉病等位基因 erl-7連鎖的分子標(biāo)記。所述分子標(biāo)記包 括 Sc0PE16-1600、Sc0PD-650、c5DNAme、PSAD60 和 PSMPSA5。
[0012] 其中，用于PCR擴(kuò)增分子標(biāo)記Sc0PE16_1600的引物序列如Seq ID No. 3和Seq ID No. 4所示；
[0013] 用于PCR擴(kuò)增分子標(biāo)記ScOPD-650的引物序列如Seq ID No. 5和Seq ID No. 6所 示；
[0014] 用于PCR擴(kuò)增分子標(biāo)記c5DNAme的引物序列如Seq ID No. 7和Seq ID No. 8所 示；
[0015] 用于PCR擴(kuò)增分子標(biāo)記PSAD60的引物序列如Seq ID No. 9和Seq ID No. 10所 示；
[0016] 用于PCR擴(kuò)增分子標(biāo)記PSMPSA5的引物序列如Seq ID No. 11和Seq ID No. 12所 不。
[0017] PCR反應(yīng)體系按10 μ 1計，包括：2XTaq PCR MasterMix 4 μ 1，上、下游引物 0.2以111〇1/1，模板0嫩20即/^1，(1(1!120補(bǔ)足至1(^1。
[0018] PCR 反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性 5 分鐘；94°C 30 秒，51°C ~67°C 30 秒，72°C 30 秒，35 個循環(huán)；72°C 10分鐘，4°C保存。
[0019] 所述分子標(biāo)記 Sc0PE16-1600、Sc0PD-650、cOTNAme、PSAD60 和 PSMPSA5 的退火溫 度分別為 67 °C、65 °C、58 °C、57 °C、51 °C。
[0020] 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述等位基因 erl-7在豌豆資源抗白粉病的分子育種中的應(yīng) 用。
[0021] 豌豆資源G0003967對中國白粉菌分離物EPYN和EPBJ均表現(xiàn)免疫。為了明確 豌豆抗白粉病資源G0003967的抗病erl等位基因，培育優(yōu)良的抗性品種，以達(dá)到有效利 用G0003967抗病基因的目的，本發(fā)明通過抗性遺傳分析，遺傳連鎖作圖以及erl的候選基 因 PsMLOl cDNA序列進(jìn)行測定，對G0003967的抗病基因進(jìn)行了鑒定，與野生型感病基因 PsMLOl cDNA序列相比，發(fā)現(xiàn)G0003967的PsMLOl cDNA序列開放閱讀框第111~120個堿 基缺失，從而引起PsMLOl蛋白功能的變化。這種小片段缺失突變是一種新的PsMLOl變異 形式，表明G0003967所含的抗白粉病的基因是一個新的erl等位基因，命名為erl-7,該等 位基因位于豌豆遺傳圖譜第VI連鎖群的erl基因座位上。
[0022] 本發(fā)明通過對豌豆抗白粉病資源G0003967的erl候選基因 PsMLOl cDNA序列分 析，發(fā)現(xiàn)了新的抗性erl等位基因 erl-7。確定了新等位基因 erl-7的cDNA序列。本發(fā)明 首次鑒定了 erl的新等位基因 erl-7,對豌豆抗白粉病育種工作具有重要意義，通過育種手 段可有效控制豌豆白粉病的發(fā)生，減輕該病害造成的經(jīng)濟(jì)損失，并為豌豆資源抗白粉病的 分子育種提供新的基因資源。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明實施例1中抗病資源G0003967 (左）和感病品種壩豌6號（右）接 種豌豆白粉菌分離物EPYN 10天后的表型。
[0024] 圖2為本發(fā)明實施例2中繪制的豌豆抗白粉病erl等位基因 erl-7遺傳連鎖圖譜。
【具體實施方式】
[0025] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0026] 以下實施例中涉及的豌豆抗白粉病品種G0003967、豌豆感白粉病品種壩豌6號均 來自于中國國家作物種質(zhì)庫。
[0027] 實施例1豌豆抗白粉病資源G0003967的抗性遺傳分析
[0028] -、植物材料及接種體
[0029] 豌豆抗白粉病品種G0003967 ;豌豆感白粉病品種壩豌6號。白粉菌（Erysiphe pisi)中國分離物EPYN。
[0030] 二、G0003967的抗性遺傳分析
[0031] 以抗病品種G0003967為父本，感病品種壩豌6號（Erl)作為母本，雜交產(chǎn)生F1 代，F(xiàn)1代自交產(chǎn)生F 2代，F(xiàn) 2代自交產(chǎn)生102個F 3家系，對上述群體進(jìn)行抗性遺傳分析、抗病 基因鑒定，并以其為作圖群體。匕和？2群體采用離體葉片分生孢子抖落法進(jìn)行接種，待豌 豆苗第3或第4莖節(jié)葉片展開時，采取葉片進(jìn)行接種，F(xiàn) 3群體采用植株接種法，F(xiàn) 3群體的 每個家系選24粒種子播種，鑒定植株對豌豆白粉菌分離物EPYN的抗感反應(yīng)。接種后，放 置于18~22°C，12h光照下培養(yǎng)。10天后，采用0~4級的病情分級標(biāo)準(zhǔn)