兩個(gè)新的達(dá)瑪烷型三萜類化合物及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥、功能食品技術(shù)領(lǐng)域，涉及絞股藍(lán)總皂苷酸水解產(chǎn)物中兩個(gè)新的 三萜類化合物及其制備方法，本發(fā)明還涉及兩個(gè)新化合物在抗腫瘤生物活性方面的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 絞股藍(lán)為萌蘆科（Cucurbitaceae)絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán)[Gynostemma pentaphyllum(Thunb. )Makino]的干燥全草，為多年生攀緣草本，主要分布于中國(guó)、日本、朝 鮮等國(guó)。絞股藍(lán)是五加科外具有人參皂苷資源的植物之一，具有滋補(bǔ)保健、抗癌防衰、增強(qiáng) 體質(zhì)和改善脂質(zhì)代謝等多種功能，被譽(yù)為"南方人參"。絞股藍(lán)為我國(guó)常用中藥和藥食同源 品，又名七膽草、小苦藥、遍地生根等。具有清熱解毒，止咳化痰，補(bǔ)氣生津，健脾安神之功 效。臨床用于治療咳嗽、痰喘、老年慢性氣管炎、傳染性肝炎及勞傷虛損等。現(xiàn)代藥學(xué)研究 表明，其主要藥效成分是絞股藍(lán)阜苷（Gypenoside，Gyp)，與人參阜苷的結(jié)構(gòu)一樣或十分接 近。絞股藍(lán)皂苷有明顯的體內(nèi)外抗腫瘤作用，其直接的細(xì)胞毒作用可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)繁 殖。
[0003] 隨著研究的深入，對(duì)人參皂苷和人參皂苷元抗腫瘤作用的構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，苷 元的活性強(qiáng)于皂苷。絞股藍(lán)皂苷元對(duì)腫瘤細(xì)胞同樣具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。在對(duì)體外多 種人腫瘤細(xì)胞的抗癌實(shí)驗(yàn)研究中，我們研發(fā)了具有抗腫瘤活性的gypensapogenin H和 gypensapogenin I，研究證明，它們對(duì)體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞的抑制作用均優(yōu)于人參阜苷-Rg3和 PPD〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是旨在從絞股藍(lán)中尋找新的具更強(qiáng)活性的抗腫瘤前體藥物，采用 了酸水解法對(duì)絞股藍(lán)總阜苷進(jìn)行水解，得到達(dá)瑪燒型三砲類化合物gypensapogenin H和 gypensapogenin I，并且研究它們的抗腫瘤生物活性和醫(yī)藥用途。
[0005] 達(dá)瑪燒型三砲類化合物gypensapogenin H和gypensapogenin I，是通過(guò)酸水解法 對(duì)絞股藍(lán)總皂苷進(jìn)行水解得到的，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0006]
[0007] 達(dá)瑪燒型三砲類化合物gypensapogenin H和gypensapogenin I的制備方法如 下：
[0008] (1)選用絞股藍(lán)（Gynoste_a pentaphyllum(Thunb. )Makino)的干燥全草 6000-8000g為原料，用30-95%工業(yè)乙醇回流提取3次（8倍量、8倍量、6倍量，質(zhì)量倍數(shù)）， 每次2h，合并提取液，減壓濃縮得乙醇提取物；
[0009](2)將上述提取物上大孔樹(shù)脂柱（HPD100)，依次用水、70 %乙醇和95%乙醇進(jìn)行 洗脫，減壓回收溶劑后得到70%乙醇洗脫物和95%乙醇洗脫物（10-15g);其中70%乙醇洗 脫物為絞股藍(lán)總皂苷部分；
[0010] (3)對(duì)步驟（2)得到的絞股藍(lán)總皂苷部分進(jìn)行酸水解，即絞股藍(lán)總皂苷溶解于酸 性有機(jī)溶液中進(jìn)行超聲酸水解，然后加水沉淀，水洗得到中性的沉淀；
[0011] (4)對(duì)步驟（3)所得的中性沉淀經(jīng)硅膠柱層析，分離后得到gypensapogenin H和 gypensapogenin I〇
[0012] 所述柱層析用的硅膠粒度為100-400目，柱層析的流動(dòng)相為石油醚-丙酮系統(tǒng) (石油醚沸程為60-90°C ) 100 : 1-2 : 1 (V/V)混合溶劑梯度洗脫，每250-400mL體積為一 個(gè)流分，共收集100-150個(gè)流分。經(jīng)薄層層析硅膠檢識(shí)，合并得到A1-A7七個(gè)流分；
[0013] 流分A2經(jīng)石油醚-丙酮10 : 1-2 : 1混合溶劑梯度洗脫，得到A2-1~A2-6的 六個(gè)流分，流分A2-1經(jīng)過(guò)重結(jié)晶得到白色粉末，即化合物gypensapogenin H。流分A2-2經(jīng) 過(guò)重結(jié)晶后得到白色粉末，即化合物gypensapogenin I。
[0014] gypensapogenin H，白色針晶（丙酮），易溶于氯仿、丙酮。Liebermann-Barchard 反應(yīng)呈陽(yáng)性、Molish反應(yīng)呈陰性，提示為三砲阜苷元化合物。gypensapogenin I，白色粉末 (丙酮），易溶于氯仿、丙酮。Liebermann-Barchard反應(yīng)呈陽(yáng)性、Molish反應(yīng)呈陰性，提示 為三萜皂苷元化合物。
[0015] 本發(fā)明所述的三砲類化合物（gypensapogenin H和gypensapogenin I)具有較好 的抗腫瘤活性，它們對(duì)體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞的抑制作用均優(yōu)于人參皂苷_Rg3和PPD。本發(fā)明化 合物的制備方法簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，提取純度高，并且獲得的化合物具有較好的抗腫瘤活性。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖 1 為化合物 gypensapogenin H 的1H NMR
[0017] 圖 2 為化合物 gypensapogenin H 的 13C NMR
[0018] 圖 3 為化合物 gypensapogenin H 的 HSQC
[0019] 圖 4 為化合物 gypensapogenin H 的 HMBC
[0020] 圖 5 為化合物 gypensapogenin H 的 IR
[0021] 圖 6 為化合物 gypensapogenin H 的 HR-TOF-MS
[0022] 圖 7 為化合物 gypensapogenin I 的1H NMR
[0023] 圖 8 為化合物 gypensapogenin I 的 13C NMR
[0024] 圖 9 為化合物 gypensapogenin I 的 HSQC
[0025] 圖 10 為化合物 gypensapogenin I 的 HMBC
[0026] 圖 11 為化合物 gypensapogenin I 的 IR
[0027] 圖 I2 為化合物 gypensapogenin I 的 HR-T0F-MS
【具體實(shí)施方式】
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 制備 gypensapogenin H 和 gypensapogenin I
[0030] 制備步驟如下：
[0031] (1)選用絞股藍(lán)的干燥全草8000g為原料，用70%工業(yè)乙醇回流提取3次（8倍量、 8倍量、6倍量，質(zhì)量倍），每次2h，合并提取液，減壓濃縮得乙醇提取物約270g ;
[0032](2)將提取物上大孔樹(shù)脂柱（HPD100)，依次用水、70%乙醇和95%乙醇進(jìn)行洗脫， 減壓回收溶劑后得到70%乙醇洗脫物，即絞股藍(lán)總皂苷部分120g和95%乙醇洗脫物15g ;
[0033] (3)將上述絞股藍(lán)總皂苷部分進(jìn)行酸水解，即絞股藍(lán)總皂苷溶解于酸性有機(jī)溶液 中進(jìn)行超聲酸水解，然后加水沉淀，水洗得到中性的沉淀；
[0034] (4)將步驟（3)得到的中性沉淀經(jīng)硅膠柱層析，柱層析用硅膠粒度為300目，柱層 析的流動(dòng)相為石油醚-丙酮系統(tǒng)（石油醚沸程為60-90°C)100 : 1-2 : 1(V/V)混合溶劑 梯度洗脫，每250mL體積為一個(gè)流分，共收集150個(gè)流分。經(jīng)薄層層析硅膠檢識(shí)，合并得到 A1-A7七個(gè)流分；流分A2經(jīng)石油醚-丙酮10 : 1~2 : 1 (V/V)混合溶劑梯度洗脫，得到 A2-1~A2-6的六個(gè)流分，流分A2-1經(jīng)過(guò)重結(jié)晶得到白色針晶，即化合物gypensapogenin H。流分A2-2經(jīng)過(guò)重結(jié)晶后得到白色粉末，即化合物gypensapogenin I。
[0035] 實(shí)施例2
[0036] 制備 gypensapogenin H 和 gypensapogenin I
[0037] 制備步驟如下：
[0038] (1)選用絞股藍(lán)的干燥全草7000g為原料，用70%工業(yè)乙醇回流提取3次（8倍量、 8倍量、6倍量，質(zhì)量倍），每次2h，合并提取液，減壓濃縮得乙醇提取物約240g ;
[0039](2)將提取物上大孔樹(shù)脂柱（HPD100)，依次用水、70%乙醇和95%乙醇進(jìn)行洗脫， 減壓回收溶劑后得到70%乙醇洗脫物，即絞股藍(lán)總皂苷部分100g和95%乙醇洗脫物12g ;
[0040] (3)將上述絞股藍(lán)總皂苷部分進(jìn)行酸水解，即絞股藍(lán)總皂苷溶解于酸性有機(jī)溶液 中進(jìn)行超聲酸水解，然后加水沉淀，水洗得到中性的沉淀；
[0041] (4)將步驟（3)得到的中性沉淀經(jīng)硅膠柱層析，柱層析用硅膠粒度為200目，柱層 析的流動(dòng)相為石油醚-丙酮系統(tǒng)（石油醚沸程為60-90°C)100 : 1-2 : 1(V/V)混合溶劑 梯度洗脫，每200mL體積為一個(gè)流分，共收集120個(gè)流分。經(jīng)薄層層析硅膠檢識(shí)，合并得到 A1-A7七個(gè)流分；流分A2經(jīng)石油醚-丙酮10 : 1~2 : 1 (V/V)混合溶劑梯度洗脫，得到 A2-1~A2-6的六個(gè)流分，流分A2-1經(jīng)過(guò)重結(jié)晶得到白色針晶，即化合物gypensapogenin H。流分A2-2經(jīng)過(guò)重結(jié)晶后得到白色粉末，即化合物gypensapogenin I。
[0042] 實(shí)施例3
[0043] 制備 gypensapogenin H 和 gypensapogenin I
[0044] 制備步驟如下：
[0045] (1)選用絞股藍(lán)的干燥全草6000g為原料，用70%工業(yè)乙醇回流提取3次（8倍量、 8倍量、6倍量，質(zhì)量倍），每次2h，合并提取液，減壓濃縮得乙醇提取物約200g ;
[0046](2)將提取物上大孔樹(shù)脂柱（HPD100)，依次用水、70%乙醇和95%乙醇進(jìn)行洗脫， 減壓回收溶劑后得到70%乙醇洗脫物，即絞股藍(lán)總皂苷部分83g和95%乙醇洗脫物10g ;
[0047] (3)將上述絞股藍(lán)總皂苷部分進(jìn)行酸水解，即絞股藍(lán)總皂苷溶解于酸性有機(jī)溶液 中進(jìn)行超聲酸水解，然后加水沉淀，水洗得到中性的沉淀；
[0048] (4)將步驟（3)得到的中性沉淀經(jīng)硅膠柱層析，柱層析用硅膠粒度為400目，柱層 析的流動(dòng)相為石油醚-丙酮系統(tǒng)（石油醚沸程為60-90°C ) 100 : 1~50 : 1~30 : 1~ 10 : 7~5 : 10~2 : 1(V/V)混合溶劑梯度洗脫，每400mL體積為一個(gè)流分，共收集100 個(gè)流分。經(jīng)薄層層析硅膠檢識(shí)，合并得到A1-A7七個(gè)流分；流分A2經(jīng)石油醚-丙酮10 : 1~ 2 : 1(V/V)混合溶劑梯度洗脫，得到A2-1~A2-6的六個(gè)流分，流分A2-1經(jīng)過(guò)重結(jié)晶得到 白色針晶，即化合物gypensapogenin H。流分A2-2經(jīng)過(guò)重結(jié)晶后得到白色粉末，即化合物 gypensapogenin I〇
[0049] 采用核磁共振等光譜法對(duì)所得gypensapogenin H和gypensapogenin I進(jìn)行結(jié)構(gòu) 鑒定。
[0050]圖 1 為化合物 gypensapogenin H 的1H NMR(600MHz，pyridine_d5)，有 6 個(gè)甲 基的特征吸收 0.80 (3H，s，18-CH3)，0.82 (3H，s，29-CH3)，0.95 (3H，s，30-CH3)，1.26 (3H，s， 28-CH3)，1.69(3H，s，27-CH3)，1.72(3H，s，26-CH 3);圖 1 還給出 4 個(gè)連氧碳上的質(zhì)子信號(hào) S 3. 93(lH，d，J = 5. 4Hz)，4. 27(lH，d，J = 8. 4Hz)，4. 56(lH，d，J = 3. 6Hz)，4. 63(lH，m)以 及一個(gè)叔碳上的質(zhì)子信號(hào)2. 70 (1H，dd，J = 5. 4,8. 4Hz)。圖2為化合物gypensapogenin H 的13C NMR(150MHz，pyridine-d5)譜，共給出30個(gè)碳信號(hào)，推測(cè)其可能為達(dá)瑪烷型三萜皂苷 元，其中包括6個(gè)連氧碳信號(hào)5 84. 0,83. 8, 77. 2, 74. 0, 71. 5, 71.5 ;2個(gè)烯碳信號(hào)5 133. 8， 130. 2,結(jié)合不飽和度推測(cè)化合物有一個(gè)雙鍵和六個(gè)環(huán)。另外，有6個(gè)角甲基信號(hào)5 29. 3， 29. 1，27. 4,22. 5，15. 7，12. 8 ;19位角甲基特征信號(hào)消失，取而代之的是S33. 1的012碳信 號(hào)，1位和3位的信號(hào)分別為S 74. 0和84. 0,推測(cè)2位和19位的碳連接成橋。將本化合物 的碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中的化合物gypensapogenin A的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照，二者母核數(shù)據(jù)基本一 致，即母核擁有3個(gè)六元環(huán)和2個(gè)五元環(huán)。
[0051] 圖3為化合物gypensapogenin H的HSQC譜，通過(guò)對(duì)除季碳以外的所有碳?xì)湫?號(hào)進(jìn)行了直接相關(guān)的歸屬，圖4為gypensapogenin H的HMBC譜，在圖4中甲基質(zhì)子信 號(hào) S〇.82(SC22.5)與 SC84.0(C-3)，SC39.4(C-4)，SC130.2(C-5)，SC27.4(C-28) 有遠(yuǎn)程相關(guān)，連氧質(zhì)子信號(hào) S 3. 03 ( S C84. 0)與 S C74. 0 (C-l)，S C130. 2 (C-5)， S C33. 1 (C-19)有遠(yuǎn)程相關(guān)，質(zhì)子信號(hào)S 4. 56 ( S C74. 0)與S C130. 2 (C-5)有遠(yuǎn)程相關(guān)，提 示存在結(jié)構(gòu)片段1，說(shuō)明雙鍵位置在C-4和C-5位之間