一種磁性分子印跡微球的制備方法及在分離富集葫蘆烷型三萜類化合物中的應(yīng)用
【專利摘要】一種磁性分子印跡微球的制備方法及在分離富集葫蘆烷型三萜類化合物中的應(yīng)用，包括Fe3O4納米顆粒制備；Fe3O4@SiO2復(fù)合顆粒制備；乙烯基修飾Fe3O4@SiO2復(fù)合顆粒；表面印跡殼層制備。其應(yīng)用：將磁性分子印跡微球與苦瓜藤提取液混合，振蕩吸附后，用磁鐵引出磁性分子印跡微球，最后加入甲醇?乙酸溶液解吸附，再用磁鐵引出磁性分子印跡微球，減壓濃縮，完成TCD的富集。本發(fā)明磁性分子印跡微球?qū)⑻禺愋越Y(jié)合位點集中到磁性顆粒表面，增大了比表面積，吸附量大且吸附速率很快，解吸附過程也只需加入少量洗脫劑，振蕩，吸附的物質(zhì)就會解吸到溶劑中，經(jīng)外部磁場分離出印跡材料后，濃縮溶劑，即可得到TCD，簡便而高效。
【專利說明】
一種磁性分子印跡微球的制備方法及在分離富集葫蘆烷型三 萜類化合物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及植物化學(xué)、分析化學(xué)、納米技術(shù)等領(lǐng)域，具體而言，涉及磁性分子印跡 材料的制備方法及利用該吸附材料富集苦瓜藤中三萜類化合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 苦瓜藤，是苦瓜植株的莖，性涼，味苦，無毒。苦瓜藤成分復(fù)雜，富含多糖、皂苷、三 萜、黃酮、生物堿、留醇等物質(zhì)。但是由于苦瓜藤有效成分含量低、分離純化困難，至今未得 到合理地開發(fā)利用?？喙铣墒旌?，其植株一般被作為農(nóng)業(yè)廢棄物丟棄，造成資源浪費?？喙?藤中總?cè)h含量高達 l_2mg/g，其中 3，7，25-Trihydroxy cucurbita-5，23-dien-19_al (簡稱 TCD)是苦瓜藤中含量相對較多的一種萌蘆烷型四環(huán)三萜類化合物，在苦瓜藤中的含量達到 0.25-0.35mg/g。據(jù)已有文獻報道，TCD 有降血糖（Keller A C，Ma J，Kavalier A，et al.Saponins from the traditional medicinal plant Momordica charantia stimulate insulin secretion in vitro[J].Phytomedicine:international journal of phytotherapy and phytopharmacology ,2011,19:32-37·)、改善膜島素抵抗（Zhang L J,Liaw C C1Hsiao P C,et al.Cucurbitane-type glycosides from the fruits of Momordica charantia and their hypoglycaemic and cytotoxic activities[J] ? Journal of Functional Foods，2014,6:564_574·)、抗癌（Bai L Y，Chiu C F，Chu P C， et al.A triterpenoid from wild bitter gourd inhibits breast cancer cells[J] ? Scientific reports,2016,6:22419·)等多種生物活性。因此，高效簡便地從苦瓜藤中富 集TCD具有重大意義。
[0003] 目前常用的分離手段依然是傳統(tǒng)的分離方法，即先溶劑萃取，然后進行柱層析分 離。單體的純化過程更復(fù)雜，需要使用多種填料，反復(fù)進行柱層析分離，或借助制備液相色 譜等方法進行純化，但是傳統(tǒng)方法工作量大，消耗溶劑多，成本很高，且大量的有機廢液處 理困難，造成環(huán)境污染。相比之下，分子印跡材料由于其獨特的預(yù)定性，特異識別性和實用 性得到了多個研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，近年來迅速發(fā)展，印跡方法不斷改善，材料類型逐漸多 元化，分析對象涉及多個學(xué)科。傳統(tǒng)的分子印跡技術(shù)存在一些技術(shù)缺陷，如模板分子洗脫困 難，使用過程中模板滲漏;吸附位點包埋過深，吸附量低、吸附速率慢等。另外傳統(tǒng)的分子印 跡材料由于顆粒微小，常需要借助高速離心或長時間沉降等方法實現(xiàn)固液分離，對其應(yīng)用 造成諸多不便。磁性分子印跡材料具備優(yōu)良磁性，可以實現(xiàn)快速固液分離，大大節(jié)省時間成 本以及人力物力。同時磁性分子印跡材料還兼具表面分子印跡的優(yōu)點，將特異性結(jié)合位點 集中到粒子表面的分子印跡層，有利于模板分子的洗脫和再結(jié)合，解決了傳質(zhì)過程緩慢、識 別位點少，結(jié)合容量低等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明第一目的在于解決現(xiàn)有的技術(shù)缺陷，提供一種磁性分子印跡微球的制備方 法。
[0005] 本發(fā)明的第二目的在于提供一種將所述的磁性分子印跡材料用于富集、分離萌蘆 烷型苦瓜藤三萜的方法。
[0006] 本發(fā)明以富集苦瓜藤中的TCD、提高吸附容量和分離效率、快速回收分子印跡材料 為目標，設(shè)計制備了單分散，表面型，核-殼結(jié)構(gòu)的磁性分子印跡材料。并將其應(yīng)用到苦瓜藤 三萜類化合物的富集和分離。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。
[0008] 本發(fā)明將磁性材料與表面分子印跡技術(shù)相結(jié)合，制備以Fe3〇4為核心，SiO2為夾層， 分子印跡層為外殼的核-殼結(jié)構(gòu)的磁性分子印跡微球。即先制備Fe 3O4納米顆粒，然后經(jīng)SiO2 修飾后再進行表面活化，添加功能基團，制得乙烯基修飾的Fe3O4OSiO2復(fù)合顆粒，最后以TCD 為模板，丙烯酰胺為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑， 乙腈和二甲基亞砜為致孔劑和溶劑，氮氣保護下熱引發(fā)聚合反應(yīng)，形成表面分子印跡層。反 應(yīng)結(jié)束后洗滌、洗脫模板、干燥即可得到T⑶磁性分子印跡微球。
[0009] 進一步的說，本發(fā)明所述的一種磁性分子印跡微球的制備方法，包括以下步驟： [0010] (I)Fe3O4納米顆粒的制備:采用溶劑熱法，將FeCl3 · 6H20溶于乙二醇中，攪拌至溶 液澄清，加入沉淀劑醋酸鈉和靜電穩(wěn)定劑檸檬酸鈉，高速攪拌至完全溶解后裝入聚四氟乙 烯水熱反應(yīng)釜，密封，馬弗爐中加熱反應(yīng)。FeCl 3 · 6H20、醋酸鈉和檸檬酸鈉的質(zhì)量比為1.5-3:6:1;每Ig FeCl3 · 6H20加乙二醇60mL;攪拌速度為200-400r/min;加熱溫度為200°C;反應(yīng) 時間為6_14h。反應(yīng)結(jié)束后自然冷卻，產(chǎn)品用無水乙醇、蒸餾水依次洗滌數(shù)遍，常溫下真空干 燥，得到Fe3〇4納米顆粒。
[0011] (2)Fe3〇4@Si02復(fù)合顆粒的制備:采用改進的St0ber法，將上述Fe 3O4納米顆粒超聲 分散于異丙醇溶液中，加入質(zhì)量百分比濃度為28 %的氨水，機械攪拌，然后加入正硅酸乙 酯，常溫下高速機械攪拌，使正硅酸乙酯在堿性條件下發(fā)生水解、聚合反應(yīng)，在Fe3〇4納米顆 粒表面形成Si〇2層。Fe3〇4納米顆粒與反應(yīng)溶劑的固液比(mg: mL)為1 -2 :1;超聲時間為10-30min;每30mL反應(yīng)溶劑加 ImL濃氨水;每IOOmg的Fe3〇4納米顆粒加0.5mL正娃酸乙酯;攪拌速 度為400r/min;反應(yīng)時間為6-12h。產(chǎn)品用無水乙醇、蒸餾水依次洗滌至無雜質(zhì)，常溫下真空 干燥，得到Fe 3O4OSiO2復(fù)合顆粒。
[0012] (3)乙烯基修飾Fe3〇4@Si〇2復(fù)合顆粒:將上述Fe3〇4@Si〇2復(fù)合顆粒超聲分散于乙醇 溶液中，機械攪拌，得到溶液A。用鹽酸調(diào)節(jié)乙醇溶液的pH至3.5-4.5，然后加入MPS，使MPS在 酸性條件下水解，得到溶液B。將溶液B緩慢滴加至溶液A中，常溫下機械攪拌反應(yīng)。Fe 3O4O SiO2復(fù)合顆粒與乙醇溶液的固液比(mg:mL)為1-2.5:1;每IOmL溶液加1-2滴質(zhì)量百分比濃 度為36%的鹽酸;每IOOmg的Fe 3O4OSiO2復(fù)合顆粒加0.25mL MPS;攪拌速度為400r/min;反應(yīng) 時間為24-48h。產(chǎn)品用無水乙醇、蒸餾水、乙腈依次洗滌數(shù)遍，得到乙烯基修飾的Fe 3O4OSiO2 復(fù)合顆粒，最后將產(chǎn)品分散在乙腈溶液中備用。
[0013] (4)表面印跡殼層的制備：將TCD和丙烯酰胺溶解于二甲基亞砜中，然后加入乙腈 溶液，超聲脫氣后冷藏靜置12h，進行自組裝預(yù)聚合，然后加入乙二醇二甲基丙烯酸酯和上 述乙烯基修飾的Fe 3O4OSiO2復(fù)合顆粒，充氮氣一段時間后，加入偶氮二異丁腈，使體系密封 在氮氣氛圍中，充分攪拌，60°C熱引發(fā)聚合反應(yīng)。TCD、丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯的 摩爾比為1:4:10-20;每lmmol TCD加2mL二甲基亞砜和280mL乙腈溶解;每Immol的丙稀酰胺 加0.3mmol的偶氮二異丁腈，充氮氣的時間為30-60min;聚合反應(yīng)時間為24h。反應(yīng)結(jié)束后在 外磁場作用下分離磁性分子印跡微球，振蕩洗脫模板分子，真空干燥。
[0014] 磁性非分子印跡微球的制備過程同上，只是不加入模板分子。
[0015] 本發(fā)明所述的一種磁性分子印跡微球在分離富集萌蘆烷型三萜類化合物中的應(yīng) 用，包括吸附、水洗、解吸附三個過程，具體按如下步驟：
[0016] (1)吸附：將所述的磁性分子印跡微球投入苦瓜藤提取液中，振蕩吸附30-240min， 吸附結(jié)束后，利用外部磁場將磁性分子印跡微球從吸附液中分離。磁性分子印跡微球與苦 瓜藤提取液的固液比(mg:mL)為1:3,吸附溫度為10-30°C。
[0017] (2)水洗:在上述完成吸附的磁性分子印跡微球中加入少量蒸餾水，振蕩10-60s， 去除磁性分子印跡微球表面殘留的吸附液，然后利用外部磁場將磁性分子印跡微球與水溶 液分離。磁性分子印跡微球與蒸餾水的固液比(mg:mL)為1: 1。
[0018] (3)解吸附：在上述水洗后的磁性分子印跡微球中加入甲醇-乙酸(9:1，v/v)溶液 中，振蕩解吸附。磁性分子印跡微球與甲醇-乙酸溶液的固液比(mg:mL)為1:3;解吸附時間 為30-240min;解吸附溫度為30-35Γ。解吸附結(jié)束后，利用外部磁場將磁性分子印跡微球從 解吸液中分離，將解吸液濃縮、干燥，得到苦瓜藤萌蘆烷型三萜類化合物干粉。
[0019] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點：
[0020] 本發(fā)明所述備的Fe3O4納米顆粒粒徑均勻，磁性良好，單分散，在溶液中超聲分散后 不會發(fā)生團聚現(xiàn)象。
[0021] 本發(fā)明所述的Fe3〇4@Si〇2復(fù)合顆粒粒徑均勾，表面光滑，有效避免了 Fe3〇4納米顆粒 易氧化、易腐蝕，易漏磁等問題。
[0022] 本發(fā)明所述的乙烯基修飾的Fe3O4OSiO2復(fù)合顆粒有效改善了 Fe3O4OSiO2在溶液中 的分散性，修飾后可長期保持在溶液中不團聚、不沉淀。且在其表面添加了功能基團，保證 了表面分子印跡層的成功包覆。
[0023]本發(fā)明所述的T⑶結(jié)構(gòu)如下：
[0025] 本發(fā)明制備的磁性分子印跡微球平均粒徑280nm，二氧化娃層厚度約40nm，表面分 子印跡層厚度約30nm。相比于傳統(tǒng)的分子印跡微球，磁性分子印跡微球?qū)⑻禺愋越Y(jié)合位點 集中到磁性顆粒表面，增大了比表面積，吸附量大且吸附速率很快。因此，在實際樣品的富 集過程中，不需要將磁性分子印跡微球裝入固相萃取柱，只需將其投入苦瓜藤提取液中，輕 輕攪拌或者振蕩一段時間即可完成吸附，然后經(jīng)外部磁場吸引即可將磁性分子印跡微球輕 松地從溶液中分離出來。解吸附過程也只需加入少量洗脫劑，振蕩，吸附的物質(zhì)就會解吸到 溶劑中，經(jīng)外部磁場分離出印跡材料后，濃縮溶劑，即可得到TCD。由此，即可完成苦瓜藤提 取液中TCD的富集，簡便而高效。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明Fe3O4納米顆粒的掃描電鏡圖（平均粒徑140nm)。
[0027] 圖2為本發(fā)明Fe3O4OSiO2復(fù)合顆粒的透射電鏡圖（平均粒徑220nm)。
[0028] 圖3為本發(fā)明磁性分子印跡微球的透射電鏡圖（平均粒徑280nm)。
[0029] 圖4為本發(fā)明紅外光譜圖（a ·Fe3〇4; b · Fe3〇4@Si02; c ·乙烯基修飾的Fe3〇4@Si02; d ·磁 性分子印跡微球）。
[0030] 圖5為本發(fā)明磁滯回線(a · Fe3〇4; b · Fe3〇4@Si〇2; c ·磁性分子印跡微球）。
[0031]圖6為本發(fā)明吸附動力學(xué)曲線。
[0032]圖7為本發(fā)明等溫吸附曲線。
[0033] 圖8為本發(fā)明磁性分子印跡微球?qū)⑶及其結(jié)構(gòu)類似物的選擇性比較。
[0034] 圖9為本發(fā)明磁性分子印跡微球與其他常用吸附材料的吸附性能比較。
【具體實施方式】
[0035] 本發(fā)明將通過以下實施例作進一步說明。
[0036] 實施例1。
[0037] a.Fe3〇4納米顆粒的制備。
[0038] 將1.05g FeCl3 · 6H20磁力攪拌溶解于60mL乙二醇中。緩慢加入3.6g醋酸鈉和0.6g 檸檬酸鈉，高速攪拌30min。裝入水熱反應(yīng)釜，密封，放入馬弗爐中200 °C反應(yīng)IOh。得到的產(chǎn) 品先用無水乙醇洗滌數(shù)次，再用蒸餾水洗滌數(shù)次，常溫下真空干燥。
[0039] b.Fe3〇4@Si02復(fù)合顆粒的制備。
[0040] 稱取200mg干燥的Fe3〇4納米顆粒，超聲分散于120mL異丙醇中，加入5mL濃氨水 (28 % )，有效機械攪拌20min得到溶液A。將ImL正硅酸乙酯分散于20mL異丙醇中得到溶液B。 機械攪拌下，將溶液B緩慢滴加至溶液A中，400r/min攪拌IOh。得到的Fe 3O4OSiO2復(fù)合顆粒用 無水乙醇洗滌數(shù)遍后再用蒸餾水洗至無雜質(zhì)。常溫下真空干燥。
[0041 ] c.Fe3〇4@Si〇2復(fù)合顆粒的乙烯基修飾。
[0042] 稱取200mg Fe3O4OSiO2復(fù)合顆粒，超聲分散于160mL乙醇溶液中，有效機械攪拌 20min得到溶液A。在IOmL的乙醇溶液(95 % )中加入一至兩滴濃鹽酸，調(diào)節(jié)pH至4左右，然后 加入0.5mL MPS，使MPS在酸性條件下水解20min，得到溶液B。機械攪拌下，將溶液B緩慢滴加 至溶液A中。400r/min攪拌48h。得到的產(chǎn)品用無水乙醇、蒸餾水、乙腈依次洗滌數(shù)遍。最后將 產(chǎn)品分散于50mL乙腈溶液中備用。
[0043] d.磁性分子印跡微球和磁性非分子印跡微球的制備。
[0044] 將0.25mmol TCD和Immol丙烯酰胺用0.5mL的二甲基亞砜溶解后，加入70mL乙腈溶 液，超聲脫氣30min，冷藏靜置12h。然后加入2.5mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯，振蕩使分散均 勾后，加入上述4mL乙烯基修飾的Fe3〇4@Si〇2復(fù)合顆粒。在上述體系中通入N2 30min后加入 50mg偶氮二異丁腈。使整個體系密封在氮氣氛圍下，60°C磁力攪拌（lOOOr/min)反應(yīng)24h。得 到的磁性分子印跡微球用無水乙醇、蒸餾水依次洗滌數(shù)遍，然后用甲醇-乙酸(9:1，v/v)35 °(：水浴振蕩洗脫模板分子，真空干燥。磁性非分子印跡微球的制備過程同上，只是不加入模 板分子。
[0045]圖1可見，溶劑熱法制備的F e 3 0 4納米顆粒平均粒徑為14 0 n m，粒徑均勾，干燥的 Fe3O4產(chǎn)品呈黑色粉末。圖2可見，F(xiàn)e3O4被SiO 2包覆之后呈均勻球形，表面光滑，SiO2層厚度約 40nm，F(xiàn)e3〇4@Si02復(fù)合微粒的平均粒徑為220nm，干燥產(chǎn)品呈棕色粉末。圖3可見，F(xiàn)e 3〇4@Si02 復(fù)合微粒包覆分子印跡層之后，顆粒呈球形，分子印跡層厚度約30nm，磁性分子印跡微球的 平均粒徑為280nm，具有以Fe3〇4為核心，Si〇2為夾層，分子印跡層為外殼的核-殼式結(jié)構(gòu)，干 燥廣品呈黃棕色粉末。
[0046] 圖4的紅外光譜圖可見，b曲線中除了580cm-1的Fe-O伸縮振動，在800cm- 1和1090cm 4出現(xiàn)新的吸收峰，經(jīng)分析后確定為Si-O-Si的伸縮振動，這表明，F(xiàn)e3〇4被SiO2層成功包覆。C 曲線中可見，經(jīng)乙烯基修飾后，1720CHT1和2940CHT1處出現(xiàn)新的特征峰，分別為C = O和C-H 鍵，表明乙烯基修飾成功，這是分子印跡層能成功包覆的前提。d曲線可見，分子印跡層包覆 后，1720cm-1和2940cm- 1處的峰明顯增強。
[0047] 圖5的磁滯回線可見，隨著二氧化硅層和分子印跡層的包覆，納米粒子的磁性逐漸 降低，包覆層越厚，磁性越小。這表明，可以通過調(diào)節(jié)包覆層的厚度來控制納米粒子的磁性。 本發(fā)明最終制備的磁性分子印跡微球的磁強足以滿足外部磁場分離的要求。
[0048] 實施例2。
[0049] 磁性分子印跡聚合物的吸附性能評價。
[0050] 1、吸附動力學(xué)。
[0051] 用吸附動力學(xué)來考察磁性分子印跡微球在TCD甲醇-水溶液中的吸附速率，及不同 吸附時間內(nèi)TCD濃度的變化規(guī)律。
[0052] 分別準確稱取IOOmg的磁性分子印跡微球和磁性非分子印跡微球于錐形瓶中，加 入20mL 50%的甲醇-水溶液，超聲20min，待分子印跡材料完全分散后用磁鐵置于錐形瓶底 部，待溶液澄清，倒出上清液。然后，迅速加入IOOmL濃度為0. lmg/mL的TCD甲醇（50 % )標準 品溶液，保持體系溫度在20 °C水浴振蕩，間隔不同時間取樣，前20min每2min取一次樣，HPLC 測定溶液中TCD濃度的變化，并計算吸附量。以吸附量Qt為縱坐標，時間t為橫坐標繪制吸附 動力學(xué)曲線。
[0053] 色譜條件：采用Aglient-1260高效液相色譜儀，蒸發(fā)光檢測器(ELSD) ,Hypersil 0DS(4.6mmX 200mm，5ym)色譜柱;流動相為乙腈(A)-水(B)，進樣量20μ1，流速為lmL/min，梯 度洗脫，洗脫方法為〇~13min，A: 40 %~100 % ; 13~15min，A: 100 %。以峰面積為縱坐標，濃 度為橫坐標繪制標準曲線?；貧w方程為:y = 14449x-664.9，R2 = 0.9988 (本發(fā)明所有HPLC數(shù) 據(jù)均采用該色譜條件檢測）。
[0054 ]圖6可見，磁性分子印跡微球和磁性非分子印跡微球?qū)CD的吸附量隨著時間的增 加是先增加后趨于平穩(wěn)的，但吸附量的增加速率卻隨著時間的增加是逐漸減小的。在前 5min，吸附量迅速增加，在5-20min增加緩慢，20min以后趨于平衡。相比之下，磁性分子印跡 微球的吸附量明顯高于磁性非分子印跡微球。
[0055] 2、等溫吸附。
[0056]為了考察在相同溫度下，磁性分子印跡微球在不同TCD濃度的樣品標準液中的飽 和吸附量。準確配制濃度范圍在0.025-0.4mg/mL之間的TCD甲醇（50% )標準液。分別稱取 10.0 mg的磁性分子印跡微球和磁性非分子印跡微球于5mL小樣瓶中（不漏液，密封好），分別 加入3mL的樣品標準液，密封，20 °C水浴振蕩3h。HPLC檢測TCD的濃度，計算吸附量。以各濃度 下的飽和吸附量Qe為縱坐標，濃度C為橫坐標繪制等溫吸附曲線。
[0057]由圖7可以看出，隨著吸附原液中TCD濃度的增加，磁性分子印跡微球和磁性非分 子印跡微球?qū)CD的吸附量逐漸增大，當TCD的初始濃度達到0.4mg/mL左右時，吸附量不再 增大，逐漸趨于平衡。磁性分子印跡微球和磁性非分子印跡微球?qū)CD甲醇-水溶液的最大 飽和吸附量分別達到66.5mg/g和36.3mg/g。磁性分子印跡微球的等溫吸附線屬于S型等溫 線，為多孔型的吸附劑。
[0058] 實施例3。
[0059] 選擇性試驗。
[0060] 為了研究印跡微球的選擇性吸附能力，選取了從苦瓜藤分離出的六種同骨架萌蘆 烷型三萜類化合物單體作為研究對象，分別為TCD、苦瓜素 I、23_乙基苦瓜素 I、苦瓜苷L (Momordicoside L)、苦瓜素 IV(MomordicineIV)、苦瓜素 Π (Momordicine Π )。將上述6種單 體化合物分別配制成濃度為0.2mg/mL的甲醇(50 % )溶液，各取IOmL，分別加入3mg的磁性分 子印跡微球，20 °C水浴振蕩3h。HPLC檢測各化合物的濃度，計算吸附量。
[0061] 六種化合物具體的結(jié)構(gòu)式分別為：


[0065] 通過分析圖8的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)磁性分子印跡微球?qū)CD有較高的吸附量，對苦瓜苷L、 苦瓜素 IV、苦瓜素 Π 的吸附量很小，對化合物苦瓜素 I、23_乙基苦瓜素 I的吸附量相對較大， 且接近。那是因為苦瓜素 I與T⑶為同分異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)非常相似，所以磁性分子印跡微球?qū)?瓜素 I的吸附量也相對較大，23-乙基苦瓜素 I雖與TCD結(jié)構(gòu)相似，但特征基團有所不同，所 以，吸附量稍小，而苦瓜苷L、苦瓜素 IV、苦瓜素 Π 與TCD基本骨架相同，但因為側(cè)鏈連糖，使 特征基團相差較大，不能與磁性分子印跡微球中的結(jié)合位點高度匹配，所以吸附量很小。磁 性非分子印跡微球?qū)?種化合物的吸附量基本相同，且吸附量都較低，這是因為，磁性非分 子印跡微球中沒有對某種分子的特異性結(jié)合位點，因此，它對六種物質(zhì)的吸附均屬于非特 異性吸附。上述實驗數(shù)據(jù)說明磁性分子印跡微球有特異性識別性能，但同時也存在交叉選 擇性，即類選擇性，對與模板分子結(jié)構(gòu)類似的分子也有一定的特異性吸附，因此，磁性分子 印跡微球除了對TCD顯示出特異性吸附外，對與TCD結(jié)構(gòu)相近的其它兩種化合物同樣有相對 較大的吸附量，但總體來說，還是對模板分子TCD的吸附量最大。
[0066] 實施例4。
[0067] 磁性分子印跡微球與其他常用吸附材料的吸附性能比較。
[0068] 為了考察磁性分子印跡微球在實際樣品中對TCD的吸附能力，本發(fā)明將其吸附性 能與4種常用的吸附材料進行比較。
[0069] 分別準確稱取3mg的DlOl大孔樹脂、硅膠、反向硅膠C18、MCI、磁性分子印跡微球和 磁性非分子印跡微球，加入IOmL已制備好的苦瓜藤提取液，25°C水浴振蕩3h后，HPLC檢測溶 液中TCD的濃度。然后過濾傳統(tǒng)的吸附材料，磁鐵分離磁性分子印跡材料，用5mL蒸餾水淋 洗。最后，在所有的吸附材料中分別加入IOmL甲醇-醋酸(9:1，v/v)溶液，35°C水浴振蕩3h。 HPLC檢測洗脫液中TCD的濃度。吸附、解吸結(jié)果如圖9所示。
[0070] 本發(fā)明所述的提取液制備方法:取IOg苦瓜藤粉末，加入150mL 70%的乙醇溶液， 70°C水浴加熱2h，濾液用容量瓶定容至250mL，制得提取液備用。
[0071] 由圖9可見，DlOl大孔樹脂對苦瓜藤提取液中TCD的吸附量最大，其次是磁性分子 印跡微球、MCI、磁性非分子印跡微球、反向硅膠C18，硅膠對TCD的吸附量最低。比較磁性分 子印跡微球和DlOl大孔樹脂的吸附數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)雖然DlOl的吸附量較大，但是其解吸量卻低 于磁性分子印跡微球。6種吸附材料對T⑶的回收率分別為97.6%、73.3%、64.4%、63.2%、 80.6%和91.6%。因此，在苦瓜藤提取液中，磁性分子印跡微球?qū)⑶有較好的吸附效果，很 適合作為一種吸附材料來富集三萜類化合物。
【主權(quán)項】
1. 一種磁性分子印跡微球的制備方法，包括以下步驟： (1) Fe3O4納米顆粒的制備:采用溶劑熱法，將FeCl3 · 6H20溶于乙二醇中，攪拌至溶液澄 清，加入沉淀劑醋酸鈉和靜電穩(wěn)定劑檸檬酸鈉，高速攪拌至完全溶解后裝入聚四氟乙烯水 熱反應(yīng)釜，密封，馬弗爐中加熱反應(yīng);FeCl 3 · 6H20、醋酸鈉和檸檬酸鈉的質(zhì)量比為1.5-3:6: 1;每Ig FeCl3 · 6H20加乙二醇60ml;攪拌速度為200-400r/min;加熱溫度為200°C;反應(yīng)時間 為6-14h;反應(yīng)結(jié)束后自然冷卻，再用無水乙醇、蒸餾水依次洗滌數(shù)遍，常溫下真空干燥，得 到Fe3〇4納米顆粒； (2) Fe3〇4@Si〇2復(fù)合顆粒的制備:將上述Fe3O4納米顆粒超聲分散于異丙醇溶液中，加入 質(zhì)量百分比濃度為28%的氨水，機械攪拌，然后加入正硅酸乙酯，常溫下高速機械攪拌，使 正硅酸乙酯在堿性條件下發(fā)生水解、聚合反應(yīng)，在Fe 3O4納米顆粒表面形成SiO2層;Fe3O4納米 顆粒與反應(yīng)溶劑的固液比(mg: ml)為1-2:1;超聲時間為10-30min;每30ml反應(yīng)溶劑加 Iml濃 氨水;每IOOmg的Fe3〇4納米顆粒加0.5ml正娃酸乙酯；攪拌速度為400r/min;反應(yīng)時間為6-12h;之后，用無水乙醇、蒸餾水依次洗滌至無雜質(zhì)，常溫下真空干燥，得到Fe 3O4OSiO2復(fù)合顆 粒； (3) 乙烯基修飾Fe3O4OSiO2復(fù)合顆粒:將上述Fe3O 4OSiO2復(fù)合顆粒超聲分散于乙醇溶液 中，機械攪拌，得到溶液A;用鹽酸調(diào)節(jié)乙醇溶液的pH至3.5-4.5，然后加入MPS，使MPS在酸性 條件下水解，得到溶液B;將溶液B緩慢滴加至溶液A中，常溫下機械攪拌反應(yīng);Fe 3O4OSiO2復(fù) 合顆粒與乙醇溶液的固液比（mg: ml)為1 -2.5 :1;每IOml溶液加1 -2滴質(zhì)量百分比濃度為 36 %的鹽酸;每IOOmg的Fe3〇4@Si02復(fù)合顆粒加0.25ml MPS;攪拌速度為400r/min;反應(yīng)時間 為24-48h;之后，用無水乙醇、蒸餾水、乙腈依次洗滌數(shù)遍，得到乙烯基修飾的Fe 3O4OSiO2復(fù) 合顆粒； (4) 表面印跡殼層的制備:將TCD和丙烯酰胺溶解于二甲基亞砜中，然后加入乙腈溶液， 超聲脫氣后冷藏靜置12h，然后加入乙二醇二甲基丙烯酸酯和上述乙烯基修飾的Fe 3O4OSiO2 復(fù)合顆粒，充氮氣一段時間后，加入偶氮二異丁腈，使體系密封在氮氣氛圍中，充分攪拌，60 °C熱引發(fā)聚合反應(yīng);TCD、丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯的摩爾比為1:4:10-20;每Immol TCD加2ml二甲基亞砜和280ml乙腈溶解;每Immol的丙稀酰胺加0.3mmol的偶氮二異丁腈，充 氮氣的時間為30-60min;聚合反應(yīng)時間為24h;反應(yīng)結(jié)束后在外磁場作用下分離磁性分子印 跡微球，振蕩洗脫模板分子，真空干燥。2. 權(quán)利要求1所述的磁性分子印跡微球在分離富集萌蘆烷型三萜類化合物中的應(yīng)用， 其特征是按如下步驟： (1) 吸附:將所述的磁性分子印跡微球投入苦瓜藤提取液中，振蕩吸附30_240min，吸附 結(jié)束后，利用外部磁場將磁性分子印跡微球從吸附液中分離;磁性分子印跡微球與苦瓜藤 提取液的固液比(mg:mL)為1:3，吸附溫度為10-30°C ; (2) 水洗:在上述完成吸附的磁性分子印跡微球中加入少量蒸餾水，振蕩10-60s，去除 磁性分子印跡微球表面殘留的吸附液，然后利用外部磁場將磁性分子印跡微球與水溶液分 離;磁性分子印跡微球與蒸餾水的固液比(mg:mL)為1:1; (3) 解吸附：在上述水洗后的磁性分子印跡微球中加入甲醇-乙酸(9:1，v/v)溶液中，振 蕩解吸附；磁性分子印跡微球與甲醇-乙酸溶液的固液比(mg:mL)為1:3;解吸附時間為30-240min;解吸附溫度為30-35Γ;解吸附結(jié)束后，利用外部磁場將磁性分子印跡微球從解吸 液中分離，將解吸液濃縮、干燥，得到苦瓜藤萌蘆烷型三萜類化合物干粉； 所述甲醇-乙酸溶液體積比(ν/V)為9:1。
【文檔編號】B01J20/28GK105921129SQ201610323922
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】曾哲靈, 張佳惠, 余平, 文學(xué)方
【申請人】南昌大學(xué)