熟知的基于基于聚乙二醇（PEG)的轉(zhuǎn)化方法來轉(zhuǎn) 化。每個(gè)原生質(zhì)體細(xì)胞用PM0N19437質(zhì)粒構(gòu)建體、pM0N63934質(zhì)粒構(gòu)建體，和呈現(xiàn)于表2中 的質(zhì)粒構(gòu)建體之一來轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化之后，轉(zhuǎn)化大豆葉原生質(zhì)體在全黑暗中孵育過夜。隨后， GUS和熒光素酶的測量通過將轉(zhuǎn)化細(xì)胞的裂解制備物的等分試樣放置于兩個(gè)不同小孔托盤 中來進(jìn)行。一個(gè)托盤用于GUS測量并且第二個(gè)托盤用于使用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)道基因測定系 統(tǒng)（PromegaCorp.，Madison，WI;參見例如PromegaNotesMagazine，第 57 期，1996,第 02 頁）來執(zhí)行雙重?zé)晒馑孛笢y定。
[0106] 對于表2中呈現(xiàn)的每個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建體執(zhí)行一個(gè)或兩個(gè)轉(zhuǎn)化。從來自每個(gè)轉(zhuǎn)化的多個(gè) 樣品確定每個(gè)3'UTR的平均表達(dá)值。樣品測量使用每個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的四次重復(fù)，或替 代地，對于兩個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的每一個(gè)以每個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建體的三次重復(fù)來進(jìn)行。平均GUS和熒 光素酶表達(dá)水平提供于表3中。在此表中，螢火蟲熒光素酶值（例如，來自pM0N19437的表 達(dá)）提供于標(biāo)記為"FLuc"的列中并且海腎熒光素酶值（例如，來自pM0N63934的表達(dá)）提 供于標(biāo)記為"RLuc"的列中。
[0107] 表3.轉(zhuǎn)化大豆葉原生質(zhì)體中的平均⑶S和熒光素酶測定值。
[0108]
[010!
[0110] 此外，為了比較每個(gè)3'UTR的相對活性，⑶S值表示為⑶S與熒光素酶活性的比 率并且相對于最佳表達(dá)非苜蓿3'UTR，即，T-Gb.FbL2-l:1 :1(SEQIDN0 :41)來標(biāo)準(zhǔn)化。表 4示出GUS/熒光素酶比率和標(biāo)準(zhǔn)化比率。另外，在此表中，螢火蟲熒光素酶值標(biāo)記為"FLuc" 并且海腎熒光素酶值標(biāo)記為"RLuc"。
[0111] 表4.相對于轉(zhuǎn)化大豆葉原生質(zhì)體中的T-Gb.FbL2-l:1 :1(SEQIDNO:41)來標(biāo)準(zhǔn) 化的⑶S/FLuc和⑶S/RLuc表達(dá)比率。
[0112]
[0114] 如表4展示，與來自陸地棉或海島棉的3'UTR相比，⑶S表達(dá)使用所有選定苜蓿 3'UTR來增強(qiáng)。舉例來說，基于相對于T-Gb.FbL2-l: 1 :1來標(biāo)準(zhǔn)化的⑶S/FLuc比率，使用 苜蓿衍生3'UTR，⑶S的表達(dá)高2. 1至18. 3倍，其中最佳表達(dá)3'UTR來自陸地棉或海島 棉。類似地，基于相對于T-Gb.FbL2-l:1 :1標(biāo)準(zhǔn)化的⑶S/RLuc比率，使用苜蓿衍生3'UTR， GUS的表達(dá)高1. 61至10. 48倍。
[0115] 實(shí)施例3
[0116] 分析3'UTR對于穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化大豆植物中的組成性⑶S表達(dá)的效果
[0117] 大豆植物用載體，尤其質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，以評估選定蒺藜狀苜蓿3'UTR對于表達(dá) 的效應(yīng)。具體來說，大豆植物用含有驅(qū)動(dòng)可操作地連接至苜蓿3'UTR的葡糖醛酸酶 (⑶S)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的組成性EXP序列的載體轉(zhuǎn)化。這些苜蓿3'UTR-轉(zhuǎn)化大豆植物與轉(zhuǎn) 化大豆植物比較，其中⑶S轉(zhuǎn)基因的表達(dá)由組成性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，并且⑶S轉(zhuǎn)基因可操作地連 接至來自海島棉的3'UTR。
[0118] 用于這些實(shí)驗(yàn)中的植物載體使用在本領(lǐng)域中已知的克隆方法來建立。所得載體包 含來自根癌農(nóng)桿菌的左邊界區(qū)域；選擇賦予抗生素大觀霉素的抗性（由擬南芥肌纖蛋白7 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)）的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的第一轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒；用于評估3' UTR的活性的第二轉(zhuǎn)基 因表達(dá)盒，所述Y UTR包含Y可操作地連接至具有可加工內(nèi)含子（⑶S-2，SEQIDN0:44) 的⑶S的編碼序列的調(diào)控表達(dá)元件組EXP-CaMV. 35S-enh+Ph. DnaK :1 :3(SEQ ID NO :42)，所 述可加工內(nèi)含子5'可操作地連接至來自蒺藜狀苜蓿或海島棉的3' UTR;和來自根癌農(nóng)桿 菌的右邊界區(qū)域。包含來自苜蓿的:V UTR的載體是pM0N109593、pM0N116803、pM0N116812、 pMONl16813、pMONl16815、pMONl16826、pMONl16827、pMONl16830、pM0N122850、pM0N122851、 pM0N122852、pM0N122853、pM0N122854、pM0N122855、pM0N122856、pM0N122857、pM0N122858、 pM0N122859、pM0N122861、pM0N122862、pM0N122863、pM0N122864、pM0N122865、pM0N122866、 PM0N122867和pM0N122868。包含來自海島棉的3' UTR的載體是pM0N102167。
[0119] 表5提供具有用于在此實(shí)施例中呈現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)化大豆植物的相應(yīng)3' UTR和SEQ ID N0的質(zhì)粒構(gòu)建體。
[0120] 表5.用于轉(zhuǎn)化大豆葉植物的質(zhì)粒構(gòu)建體和3'UTR描述。
[0121]
[0122]
[01 23]大丄7十、7只L_1々M口：Jiv'l'l困71 寸十？'I七A/f厶十？'I七。UU?？冢篔仏達(dá)使用選 定組織的組織學(xué)切片來定性測定。對于組織化學(xué)⑶S分析，將全組織切片與⑶S染色溶液X-Gluc(5-溴基-4-氯基-3-吲哚基-b-葡糖苷酸）（lmg/ml) -起孵育適當(dāng)長度時(shí)間、沖 洗，并且視覺檢查藍(lán)色著色。⑶S活性使用選定植物器官和組織、通過直接肉眼檢查或在顯 微鏡下的檢查來定性地確定。私世代植物針對在Vn5根、Vn5庫葉、Vn5源葉、R1源葉、R1 葉柄、R1花朵、黃色圓莢體胚芽（大約R8發(fā)育期）、黃色圓莢體子葉（大約R8發(fā)育期）、R3 未成熟種子、R3圓莢體和R5子葉中的表達(dá)來檢查。
[0124] 相對于由包含來自海島棉的3'UTR的pM0N102167賦予的表達(dá)，還分析⑶S表達(dá) 的定量變化，如表6-13展示。對于此定量分析，從轉(zhuǎn)化植物的選定組織中提取總蛋白質(zhì)。在 50y1的總反應(yīng)體積中，一微克總蛋白質(zhì)與熒光底物4-甲基傘形酮-D-葡糖苷酸（MUG) 一起使用。反應(yīng)產(chǎn)物，4-甲基傘形酮（4-MU)在羥基得以電離的較高pH下最大限度地發(fā)熒 光。添加碳酸鈉的堿性溶液同時(shí)停止測定并調(diào)整pH用于量化熒光產(chǎn)物。使用具有Micromax 讀取器的Fluoromax-3(Horiba;Kyoto,Japan)以365nm下的激發(fā)，445nm下的發(fā)射來測量 熒光，所述讀取器具備設(shè)定為激發(fā)2nm，發(fā)射3nm的縫隙寬度。
[0125] 表6和7展示在R。世代植物組織中測量的平均定量表達(dá)水平。未測定的那些組 織在兩個(gè)表中展示為空白單元。
[0126]
[0127」
[0128
[0129] 如表6和7展示，在與海島棉衍生3'UTR相比時(shí)，在包含不同苜蓿3'UTR的穩(wěn) 定轉(zhuǎn)化大豆植物的組織中的由相同EXP驅(qū)動(dòng)的表達(dá)是不同的。
[0130] 表8和9展示在與海島棉衍生3'UTR相比時(shí)，包含不同苜蓿3'UTR的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化 大豆植物的組織中的倍數(shù)表達(dá)差異。
[0131]
[0132]
[0133]
[0134] 如表8和9展示，在與用包含來自海島棉的3'UTR的pM0N102167轉(zhuǎn)化的大豆植 物相比時(shí)，組織包含不同苜蓿3'UTR的轉(zhuǎn)化大豆植物中的表達(dá)是不同的。舉例來說，兩個(gè) 苜蓿 3，UTR，T-Mt.AC145767v28-l:1 :2(SEQIDN0:1)和T-Mt.Lox-1-1 :2 :1(SEQIDNO: 14)在所有組織中導(dǎo)致組成性EXP，EXP-CaMV. 35S-enh+Ph.DnaK:1 :3(SEQIDNO:42)的表 達(dá)增強(qiáng)。其它苜蓿3'UTR在一些組織中提供組成性EXP的增強(qiáng)表達(dá)，而其他組織中減少 表達(dá)。舉例來說，3'UTRT-Mt.Sali3-2-l:2 :1(SEQIDNO:26)Vn5 根、Vn5 庫葉、Vn5 源 葉、R1源葉、黃色圓莢體胚芽和黃色圓莢體子葉中提供2. 19至8. 05倍表達(dá)增加，而在R1花 朵和R5 子葉中減少表達(dá)。此外，3'UTRT-Mt.AC140914v20-l:2 :1(SEQIDN0:2)在Vn5 根、Vn5庫葉、Vn5源葉、黃色圓莢體胚芽、黃色圓莢體子葉、R3未成熟種子和R5子葉中提供 1. 88至4. 12倍表達(dá)增加，而在R1源葉、R1花朵中減少表達(dá)，并且在R3圓莢體中保持表達(dá) 相對相同。另外，3'UTRT-Mt.0xr-1 :2 :1(SEQIDN0:17)在Vn5 根、Vn5 庫葉、Vn5 源葉、 R1源葉、黃色圓莢體胚芽、黃色圓莢體子葉和R3圓莢體中提供2. 19至10. 90倍表達(dá)增加， 而在R1花朵和R5子葉中減少表達(dá)，并且在R3未成熟種子中保持表達(dá)相對相同。
[0135] 將包含不同苜蓿3'UTR的一些轉(zhuǎn)化大豆植物帶至&世代。表10和11展示測定 組織的平均⑶S表達(dá)值。表12和13展示相對于來自海島棉的3'UTR的表達(dá)倍數(shù)差異。
[0136]
[0137] 如表10和11展示，在與海島棉衍生3'UTR相比時(shí)，在包含不同苜蓿3'UTR的 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化大豆植物的組織中，由相同EXP驅(qū)動(dòng)的表達(dá)是不同的。表12和13展示相對于用 包含來自海島棉的3'UTR的pM0N102167轉(zhuǎn)化的組織，包含不同苜蓿3'UTR的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化 大豆植物的組織中的倍數(shù)表達(dá)差異。
[0138]
[0139] 表13. &世代轉(zhuǎn)化大豆植物的黃色圓莢體胚芽、黃色圓莢體子葉、R3未成熟種子、R3圓莢體和R5子葉中的倍數(shù)表達(dá)差異。
[0140]
[0141] 如表12和13展示，相對于用在札世代中包含來自海島棉的3'UTR的pM0N102167 轉(zhuǎn)化的植物，若干苜蓿:VUTR增強(qiáng)組成性EXP元件，EXP-CaMV. 35S-enh+Ph.DnaK: 1 :3(SEQ IDN0:42)的表達(dá)。舉例來說，3'UTRT-Mt.AC145767v28-l:1 :2(SEQIDN0:1)在所有 測定組織中提供(^3表達(dá)的3.10至21.65倍增強(qiáng)。3'17^1'-]\^.53113-2-1 :2:1(5￡〇10 NO:26)在所有測定組織中提供⑶S表達(dá)的1. 52至8. 90倍增強(qiáng)。：VUTRT-Mt.Oxr-1 :2 : 1(SEQIDN0:17)在大多數(shù)組織中提供增強(qiáng)，但是相對于用T-Gb.E6-3b:l:l(SEQIDNO: 40)轉(zhuǎn)化的植物，減少R3未成熟種子中的表達(dá)。
[0142] 前述實(shí)驗(yàn)表明取決于所選擇的特定3'UTR，蒺藜狀苜蓿衍生3'UTR元件以不同 方式影響組成性EXP元件EXP-CaMV. 35S-enh+Ph.DnaK:1 :3(SEQIDN0 :42)的表達(dá)。在 許多情況下，相對于用包含來自海島棉的3'UTR的pM0N102167轉(zhuǎn)化的植物，在用包含苜 蓿3'UTR的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物的某些組織中，存在增強(qiáng)的表達(dá)。然而，增強(qiáng)效應(yīng) 并非在所有植物組織觀察到并且在許多情況下，表達(dá)在一些組織中減弱并且在使用苜蓿 UTR的其他組織中增強(qiáng)。因此，使用選定苜蓿3'UTR允許"微調(diào)"具體轉(zhuǎn)基因的表達(dá)譜 并且在與可轉(zhuǎn)錄DNA分子的可操作連接中可與不同表達(dá)元件，如啟動(dòng)子、前導(dǎo)區(qū)和內(nèi)含子 組合使用以提供特定組織中的最優(yōu)表達(dá)，同時(shí)在對于特定可轉(zhuǎn)錄DNA分子不太理想的組織 中減少表達(dá)。
[0143] 實(shí)施例4
[0144] 分析3'UTR對于穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化大豆植物中的種子優(yōu)選⑶S表達(dá)的效果
[0145] 大豆植物用載體，尤其質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，以評估選定苜蓿3'UTR對于表達(dá)的效 應(yīng)。具體來說，大豆植物用含有驅(qū)動(dòng)可操作地連接至苜蓿3'UTR的葡糖醛酸酶（⑶S) 轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的種子表達(dá)EXP序列的DNA載體轉(zhuǎn)化。這些苜蓿3'UTR-轉(zhuǎn)化大豆植物與轉(zhuǎn) 化大豆植物比較，其中⑶S轉(zhuǎn)基因的表達(dá)由種子表達(dá)EXP序列驅(qū)動(dòng)，并且⑶S轉(zhuǎn)基因可操作 地連接至來自海島棉的3'UTR。
[0146] 用于這些實(shí)驗(yàn)中的植物載體使用在本領(lǐng)域中已知的克隆方法來建立。所得載體包 含來自根癌農(nóng)桿菌的左邊界區(qū)域；選擇賦予抗生素大觀霉素的抗性（由擬南芥肌纖蛋白7 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)）的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的第一轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒；用于評估3'UTR的活性的第二轉(zhuǎn)基 因表達(dá)盒，所述YUTR包含Y可操作地連接至具有可加工內(nèi)含子（⑶S-2，SEQIDN0:44) 的⑶S的編碼序列的提供種子優(yōu)選表達(dá)的EXP元件EXP-Gm.Sphasl:1 :1(SEQIDNO:50)， 所述可加工內(nèi)含子5'可操作地連接至來自蒺藜狀苜?；蚝u棉的3'UTR;和來自根癌農(nóng) 桿菌的右邊界區(qū)域。包含來自苜蓿的3'UTR的植物表達(dá)載體是pM0N116832、pM0N116834、 pMONl16835、pMONl16841、pM0N122869、pM0N122870、pM0N122871、pM0N122872、pM0N122873、 pM0N122874、pM0N122875、pM0N122876、pM0N122878、pM0N122879、pM0N122880、pM0N122881、 pM0N122882、pM0N122883、pM0N122885、pM0N122887、pM0N122888 和pM0N126122。包含來自 海島棉的3'UTR的載體是pM0N83028。
[0147] 表14提供具有針對性提供定量測定數(shù)據(jù)的相應(yīng)YUTR、SEQIDN0和世代的質(zhì) 粒構(gòu)建體。
[0148] 表14.用于轉(zhuǎn)化大豆植物的質(zhì)粒構(gòu)建體和相應(yīng)3'UTR。
[0149]
[0150] 將大豆植物轉(zhuǎn)化并且所測定的⑶S如實(shí)施例3中描述。表15和16提供R。世代 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化大豆植物的定量平均GUS值。
[0151] 表15.R。世代轉(zhuǎn)化大豆植物的黃色圓莢體胚芽、黃色圓莢體子葉、R3未成熟種子、 R3圓莢體和R5子葉中的平均⑶S表達(dá)。
[0152]
[0153] 表16.R。世代轉(zhuǎn)化大豆植物的Vn5根、Vn5庫葉、Vn5源葉、R1源葉、R1葉柄和R1 花朵中的平均⑶S表達(dá)。
[0154]
[0155]
[0156] 如可以在表15和16中看出，大多數(shù)苜蓿3'UTR僅在種子衍生組織中影響種子 優(yōu)選EXP元件，EXP-Gm.Sphasl:1 :1(SEQIDN0 :50)的表達(dá)，除了在R1源葉、R1葉柄和R1 花朵中增強(qiáng)(^^表達(dá)的1'-1^^口1-1:1:2(3￡〇10勵(lì) ：5)以外。若干苜蓿3/17^在黃色 圓莢體胚芽和黃色圓莢體子葉中提供較高表達(dá)，如T-Mt.AC145767v28-l:l:2(SEQIDN0: l)、T-Mt.RD22-l:2:l(SEQIDN0:24)和T-Mt.AC153125V10-l:2:l(SEQIDN0:4)。因此， 這些3'UTR可在種子發(fā)育較晚階段期間理想地增強(qiáng)種子啟動(dòng)子的表達(dá)。相對于許多其他 3'UTR，3'UTRT-Mt.Exprl-1:2:1(SEQIDN0:7)在R5子葉和黃色圓莢體子葉中提供較 高表達(dá)，因而可適用于對于種子發(fā)育的較寬窗口提供較高子葉表達(dá)。在一些情況下，3'UTR 在黃色圓莢體胚芽和黃色圓莢體子葉中提供更均一水平種子表達(dá)，如在使用T-Mt.FBA-1 : 2 :1(SEQIDNO:9)、T-Mt.Zfp-1 :2 :1(SEQIDNO:30)、T-Mt.Pipl-1 :2 :1(SEQIDN0 :18) 和T-Mt.Pt2-1 :2 :2(SEQIDNO:23)時(shí)。
[0157]允許包含T-Mt.Zfp-1 :2 :1(SEQIDNO:30)、T-Mt.Apx-1 :1 :2(SEQIDNO:5)、 T-Mt.Suil-1 :1 :2(SEQIDNO:29)和T-Mt.EFla-1 :1 :2(SEQIDNO:6)的R。世代植物產(chǎn) 生種子并且種植用于&世代研究。表17示出事件的平均定量測定數(shù)據(jù)的比較，這些事件 包括包含苜蓿3'UTR的這些&世代植物和用包含來自海島棉的3'UTRT-Gb.E6-3b:1 : 1(SEQIDN0:40)的pM0N83028 轉(zhuǎn)化的植物。
[0158] 表17. &世代轉(zhuǎn)化大豆植物的黃色圓莢體胚芽、黃色圓莢體子葉和R5子葉中的平 均⑶S表達(dá)。
[0159]
[0160] 如n」以在表17中宥出，與T-Gb.E6-3b:1
:1相比，苜宿1 17^小問地影啊在勝胎 和子葉組織中的表達(dá)。舉例來說，相對于T-Gb.E6-3b:1 :1，T-Mt.Apx-1 :1 :2(SEQIDN0: 5)和T-Mt.Suil-1 :1 :2(SEQIDNO:29)增強(qiáng)黃色圓莢體胚芽、黃色圓莢體子葉和R5子葉 中的種子優(yōu)選EXP元件的表達(dá)。T-Mt.EFla-l:l:2(SEQIDN0:6)增強(qiáng)黃色圓莢體胚芽和 黃色圓莢體子葉中的表達(dá)，但是不增強(qiáng)在R5子葉中的表達(dá)。T-Mt.Zfp-1:2:1(SEQIDN0: 30)減少較晚發(fā)育黃色圓莢體胚芽和黃色圓莢體子葉中的表達(dá)，但是增強(qiáng)在R5子葉中的表 達(dá)。
[0161