植物調控元件和其用圖
【專利說明】植物調控元件和其用途
[0001] 相關申請的引用
[0002] 本申請要求2013年3月14日提交的美國臨時序列號61/785, 268的權益，所述申 請以引用的方式整體并入本文。
[0003] 序列表的并入
[0004] 名稱為"M0NS332W0.txt"的文件中含有的序列表通過電子方式提交來與本文一起 提交并且以引用的方式并入本文，所述序列表是52. 7千字節(jié)（在MicrosoftWindows? 中測量的大?。┎⑶覄?chuàng)建于2014年3月11日。 發(fā)明領域
[0005] 本發(fā)明涉及植物分子生物學、植物遺傳工程和適用于調節(jié)植物中的基因表達的 DNA分子的領域。
【背景技術】
[0006] 調控元件是通過調節(jié)可操作連接可轉錄DNA分子的轉錄來調控基因活性的遺傳 元件。這類元件可包括啟動子、前導區(qū)、內含子和3'未翻譯區(qū)域并且適用于植物分子生物 學和植物遺傳工程領域。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明提供用于包含調控元件的植物和構建體中的新穎調控元件。本發(fā)明還提供 包含調控元件的轉基因植物細胞、植物和種子。在本文公開的一個實施方案中，調控元件可 操作地連接至可轉錄DNA分子。在某些實施方案中，可轉錄DNA分子相對于調控序列是異源 的。本文還提供制造和使用本文公開的調控元件的方法，包括包含調控元件的構建體，和包 含可操作地連接至相對于調控元件異源的可轉錄DNA分子的調控元件的轉基因植物細胞、 植物和種子。
[0009] 因此，在一方面，本發(fā)明提供包含選自由以下組成的組的DNA序列的重組DNA分 子：（a)具有與SEQIDN0 :1-37中任何一個至少約85%序列同一性的DNA序列；(b)包含 SEQIDN0:1-37中任何一個的DNA序列；和（c)SEQIDN0:1-37中任何一個的片段，其中 所述片段具有基因調控活性；其中所述DNA序列可操作地連接至異源可轉錄DNA分子。"異 源可轉錄DNA分子"是指所述可轉錄DNA分子相對于其可操作地連接的所述DNA序列為異 源的。在具體實施方案中，重組DNA分子包含與SEQIDN0:l-37中任何一個的DNA序列具 有至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、 至少98 %或至少99 %序列同一性的DNA序列。在具體實施方案中，異源可轉錄DNA分子包 含具有農藝學重要性的基因，如能夠在植物中提供除草劑抗性或害蟲抗性的基因。在其他 實施方案中，本發(fā)明提供包含如本文提供的重組DNA分子的構建體。
[0010] 在另一方面，本文提供轉基因植物細胞，其包括包含選自由以下組成的組的DNA 序列的重組DNA分子：（a)具有與SEQIDN0 :1-37中任何一個至少約85%序列同一性的 DNA序列；（b)包含SEQIDN0 :1-37中任何一個的DNA序列；和（c)SEQIDN0 :1-37中任 何一個的片段，其中所述片段具有基因調控活性；其中所述DNA序列可操作地連接至異源 可轉錄DNA分子。在某些實施方案中，轉基因植物細胞是單子葉植物細胞。在其他實施方 案中，轉基因植物細胞是雙子葉植物細胞。
[0011] 在仍然另一個方面，本文進一步提供轉基因植物或其部分，其包括包含選自由以 下組成的組的DNA序列的重組DNA分子：（a)具有與SEQIDN0 :1-37中任何一個至少85% 序列同一性的DNA序列；（b)包含SEQIDN0 :1-37中任何一個的DNA序列；和（c)SEQID NO:1-37中任何一個的片段，其中所述片段具有基因調控活性；其中所述DNA序列可操作地 連接至異源可轉錄DNA分子。在具體實施方案中，轉基因植物是相對于起始轉基因植物的 任何世代的子代植物并且包含重組DNA分子。本文還提供包含在生長時產生這類轉基因植 物的重組DNA分子的轉基因種子。
[0012] 在另一方面，本發(fā)明提供產生商品產品的方法，其包括獲得含有本發(fā)明的重組DNA 分子的轉基因植物或其部分并且從其中產生所述商品產品。在一個實施方案中，商品產品 是加工種子、顆粒、植物部分和粗粉。
[0013] 在仍然另一個方面，本發(fā)明提供產生包含本發(fā)明的重組DNA分子的轉基因植物的 方法，其包括用本發(fā)明的重組DNA分子來轉化植物細胞以產生轉化植物細胞并且使轉基因 植物從所述轉化植物細胞再生。
【附圖說明】
[0014] 圖1 :展示本發(fā)明的表達盒配置。
[0015] 序列簡述
[0016]SEQIDN0 :1-30、38-41、49 和 56 是 3'UTR序列。
[0017] SEQ ID N0 :31、35、42、47、48、50、51、52、53、54和55是調控表達元件組伍乂?）的 DNA序列，其包含5'可操作地連接至前導序列的啟動子序列，所述前導序列5'可操作地 連接至內含子序列；或5'可操作地連接至前導序列的啟動子序列。
[0018]SEQIDN0:32、36 和 43 是啟動子序列。
[0019]SEQIDN0 :33 和 37 是前導序列。
[0020] SEQIDN0 :34是內含子序列。
[0021] SEQIDN0 :44是具有可加工內含子的0 -葡糖醛酸酶（⑶S)的編碼序列。
[0022] SEQIDN0 :45和46是熒光素酶編碼序列。
[0023] 發(fā)明詳述
[0024] 本發(fā)明提供在植物中具有基因調控活性的DNA分子。這些DNA分子的核苷酸序列 提供為SEQIDN0 :1-37。這些DNA分子能夠影響植物組織中的可操作地連接可轉錄DNA分 子的表達，并且因此調控轉基因植物中的可操作地連接轉基因的基因表達。本發(fā)明還提供 修飾、產生和使用這些分子的方法。本發(fā)明還提供包括含有本發(fā)明的重組DNA分子的轉基 因植物細胞、植物、植物部分和種子的組合物，和制備和使用所述組合物的方法。
[0025] 提供以下定義和方法是為了更好地界定本發(fā)明以及指導本發(fā)明的一般技術人員 實踐本發(fā)明。除非另外指出，否則術語應按照相關技術領域的普通技術人員的常規(guī)用法來 理解。
[0026] DNA 分子
[0027] 如本文使用，術語"DNA"或"DNA分子"是指基因組或合成來源的雙鏈DNA分子，即， 脫氧核苷酸堿基的聚合物。如本文使用，術語"DNA序列"是指DNA分子的核苷酸序列。本 文使用的命名法對應于美國聯邦法規(guī)§ 1.822的標題37,并且在WIP0標準ST. 25(1998)， 附錄2,表1和3的表中闡明。
[0028] 如本文使用，"重組DNA分子"是包含在沒有人為干預的情況下完全不會自然出現 的組合DNA分子的DNA分子。例如，重組DNA分子可為包含相對于彼此異源的至少兩個DNA 分子的DNA分子，包含與在自然界中存在的DNA序列有偏差的DNA序列的DNA分子，或通過 遺傳轉化并入宿主細胞的DNA中的DNA分子。
[0029] 如本文使用，術語"序列同一性"是指兩個最佳比對DNA序列相同的程度。最優(yōu)序 列比對通過手動地比對兩個序列，例如，參考序列和另一個DNA序列，以在具有適當內部核 苷酸插入、缺失或間隙的序列比對中最大限度地提高核苷酸匹配的數目來建立。如本文使 用，術語"參考序列"是指提供為SEQIDN0 :1-37的DNA序列。
[0030] 如本文使用，術語"％序列同一性"或" ％同一性"是同一性分率乘以100。與參 考序列最佳比對的DNA序列的"同一性分率"是最優(yōu)比對中的核苷酸匹配的數目，除以參考 序列中的核苷酸的總數，例如，整個參考序列的全長中的核苷酸的總數。因此，本發(fā)明的一 個實施方案提供包含DNA序列的DNA分子，所述DNA序列在與本文提供為SEQIDN0 :1-37 的參考序列最佳比對時，與參考序列具有至少約85%同一性、至少約86%同一性、至少約 87%同一 ,性、至少約88%同一,性至少約89%同一,性、至少約90 %同一,性、至少約91 %同一 性、至少約92 %同一,性、至少約93%同一,性、至少約94 %同一,性、至少約95%同一,性、至少 約96 %同一,性、至少約97 %同一,性、至少約98 %同一,性、至少約99 %同一,性或至少約100 % 同一性。
[0031] 調控元件
[0032] 調控元件如啟動子、前導區(qū)、增強子、內含子和轉錄終止區(qū)域（或3' UTR)在活細 胞中的總體基因表達中起整體作用。如本文使用，術語"調控元件"是指具有基因調控活性 的DNA分子。如本文使用，術語"基因調控活性"是指例如通過影響可操作地連接可轉錄DNA 分子的轉錄和/或翻譯來影響可操作地連接可轉錄DNA分子的表達的能力。因此，在植物 中起作用的調控元件，如啟動子、前導區(qū)、增強子、內含子和3' UTR適用于經由遺傳工程來 修飾植物表現型。
[0033] 如本文使用，"調控表達元件組"或"EXP"序列可指可操作地連接調控元件，如增強 子、啟動子、前導區(qū)和內含子的群組。因此，調控表達元件組可包含例如5'可操作地連接至 前導序列的啟動子，所述前導序列進而5'可操作地連接至內含子序列。
[0034] 調控元件可通過其基因表達模式來表征，例如，正性和/或負性效應如組成性、時 間、空間、發(fā)育、組織、環(huán)境、生理、病理、細胞周期和/或化學響應表達，和其任何組合，以及 定量或定性指示。如本文使用，"基因表達模式"是將可操作地連接DNA分子轉錄至轉錄RNA 分子中的任何模式。轉錄RNA分子可翻譯來產生蛋白質分子或可提供反義或其他調控RNA 分子，如雙鏈RNA(dsRNA)、轉移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)、小分子RNA(miRNA)等。
[0035] 如本文使用，術語"蛋白質表達"是轉錄RNA分子翻譯至蛋白質分子中的任何模 式。蛋白質表達可通過其時間、空間、發(fā)育或形態(tài)性質，以及通過定量或定性指示來表征。
[0036] 啟動子適用作調節(jié)可操作地連接可轉錄DNA分子的表達的調控元件。如本文使 用，術語"啟動子"總體上是指涉及識別和結合RNA聚合酶II和其他蛋白質，如反式作用轉 錄因子，以啟始轉錄的DNA分子。啟動子可最初從基因的5'未翻譯區(qū)域（5'UTR)識別。 或者，啟動子可為合成產生或操縱的DNA分子。啟動子還可為嵌合的。嵌合啟動子經由兩 個或更多個異源DNA分子的融合來產生。適用于實施本發(fā)明的啟動子包括SEQIDNO:32 和36,包括片段或其變體。在本發(fā)明的具體實施方案中，如本文描述的要求保護的DNA分子 和其任何變體或衍生物，進一步定義為包含啟動子活性，即，能夠充當啟動子宿主細胞，如 在轉基因植物中。在更進一步特異性實施方案中，片段可定義為展現其源自的起始啟動子 分子所具有的啟動子活性，或片段可包含"最小啟動子"，其提供基礎水平轉錄并且由用于 識別和結合RNA聚合酶II復合物以便啟始轉錄的TATA盒或等效DNA序列組成。
[0037] 在一個實施方案中，提供本文公開的啟動子序列的片段。啟動子片段可包括啟動 子活性，如上所述，并且可單獨或與其他啟動子和啟動子片段組合使用，如在構建嵌合啟動 子中，或與其他EXP和EXP片段組合。在具體實施方案中，提供啟動子的片段，其包含本文 公開的具有啟動子活性的DNA分子的至少約50、至少約75、至少約95、至少約100、至少約 125、至少約150、至少約175、至少約200、至少約225、至少約250、至少約275、至少約300、 至少約500、至少約600、至少約700、至少約750、至少約800、至少約900或至少約1000個 鄰接核苷酸，或更長。從起始啟動子分子產生這類片段的方法在本領域中是熟知的。
[0038] 來自表示為SEQIDN0 :32和36的任何啟動子的組合物，如內部或5'缺失，例如， 可使用本領域中熟知方法來產生以改進或改變表達，包括移除對于表達具有正性或負性效 應的元件；復制對于表達具有正性或負性效應的元件；和/或復制或移除對于表達具有組 織或細胞特異性效應的元件。從表示為SEQIDN0 :32和36的任何啟動子產生的包含其中 TATA盒元件或其等效序列和下游序列得以移除的3'缺失的組合物可用于例如制得增強 子元件?？僧a生進一步缺失以移除對于表達具有正性或負性；組織特異性；細胞特異性；或 定時特異性（諸如但不限于，晝夜節(jié)律）效應的任何元件。表示為SEQIDN0 :32和36的 任何啟動子和從其中衍生的片段或增強子可用于制得嵌合轉錄調控元件組合物。
[0039] 根據本發(fā)明，啟動子或啟動子片段可針對已知啟動子元件，S卩，DNA序列特性，如 TATA盒和其他已知轉錄因子結合位點基元的存在來分析。這類已知啟動子元件的識別可由 本領域技術人員用于設計具有與原始啟動子類似表達模式的啟動子的變體。
[0040] 如本文使用，術語"前導區(qū)"是指從基因的未翻譯5'區(qū)域（5'UTR)識別的DNA分 子并且總體上定義為轉錄起始位點（TSS)與蛋白質編碼序列起始位點之間的核苷酸節(jié)段。 或者，前導區(qū)可為合成產生或操縱DNA元件。前導區(qū)可用作調節(jié)可操作地連接可轉錄DNA 分子的表達的5'調控元件。前導區(qū)分子可與異源啟動子或與其原生啟動子一起使用。適 用于實施本發(fā)明的前導區(qū)包括SEQIDN0 :33和37或片段或其變體。在具體實施方案中， 這類DNA序列可定義為能夠在宿主細胞，包括例如轉基因植物細胞中充當前導區(qū)。在一個 實施方案中，這類DNA序列可解碼為包含前導區(qū)活性。
[0041] 表示為SEQIDN0 :33和37的前導序列可包含調控元件或可采用可對于可操作地 連接可轉錄DNA分子之轉錄或翻譯具有效應的次級結構。表示為SEQIDN0 :33和37的前 導序列可根據本發(fā)明用于制得影響可操作地連接DNA分子之轉錄或翻譯的嵌合調控元件。
[0042] 如本文使用，術語"內含子"是指DNA分子可從基因識別并且可總體上定義為在翻 譯之前的信使RNA(mRNA)處理期間剪接的區(qū)域?；蛘?，內含子可為合成產生或操縱DNA元 件。內含子可含有實現可操作地連接基因的轉錄的增強子元件。內含子可用作調節(jié)可操作 地連接可轉錄DNA分子的表達的調控元件。構建體可包括內含子，并且內含子可或可不相 對于可轉錄DNA分子異源。在本領域中的內含子的實例包括水稻肌動蛋白內含子和玉米 HSP70內含子。
[0043] 在植物中，在基因構建體中包含一些內含子導致相對于缺乏內含子的構建體， mRNA和蛋白質積聚增加。此效應被稱為基因表達的"內含子介導增強" (ME)。已知刺激植 物中的表達的內含子已經在玉米基因（例如，tubAl、Adhl、Shi和Ubil)、水稻基因（例如， tpi)和雙子葉植物基因如來自矮牽?；ǖ哪切┗颍ɡ?，rbcS)、馬鈴薯（例如，st-lsl) 和擬南芥（例如，ubq3和patl)中識別。已經證明內含子的剪接位點內的缺失或突變減少 基因表達，指示剪接可能為ME所需要。然而，雙子葉植物中的頂E已經通過來自擬南芥的 patl基因的剪接位點內的點突變來證明。相同內含子在一種植物中的多次使用在某些情況 下證明為展現缺點。在那些情況下，需要具有基本控制元件之集合來構建適當重組DNA元 件。
[0044] 適用于實施本發(fā)明的內含子包括SEQIDN0:34。來自表示為SEQIDN0:34的內 含子的組合物可包含順式調控元件的內部缺失或復制；且/或包含內含子/外顯子剪接接 合點的5'和3'DNA序列的改變在可操作地連接至啟動子+前導區(qū)或嵌合啟動子+前導 區(qū)和編碼序列時可用于改進表達或表達特異性。當修飾內含子/外顯子界限序列時，避免 使用正好在剪接位點（GT)的5'末端之前的核苷酸序列AT或核苷酸A和相應地正好在剪 接位點（AG)的3'末端之后的核苷酸G或核苷酸序列TG可有利于消除將信使RNA加工成 最終轉錄物期間所形成的不必要起始密碼子的可能性。因此，內含子的5'或3'末端剪接 接合位點周圍的DNA序列可以此方式來修飾。如本文描述和經由在本領域中已知的方法改 變的內含子和內含子變體可如工作實例中所描述來憑經驗地測試以確定內含子對于可操 作地連接DNA分子的表達的效應。也可產生包含內含子/外顯子剪接接合點的5'和:V 區(qū)域的改變以減少引入在加工和剪接信使RNA之后所得轉錄物中產生的錯誤起始和停止 密碼子的可能性。內含子可如工作實例中所描述憑經驗地測試以確定內含子對于轉基因的 表達的效應。
[0045] 如本文使用，術語"3'轉錄終止分子"、"3'未翻譯區(qū)域"或"3'UTR"是指在mRNA 分子的3'部分的未翻譯區(qū)域的轉錄期間所使用的DNA分子。mRNA分子的3'未翻譯區(qū)域 可通過特異性裂解和也稱為聚腺苷酸尾部的3'多聚腺苷酸化來產生。3'UTR可以可操 作地連接至和位于可轉錄DNA分子的下游并且可包括多聚腺苷酸化信號和能夠影響轉錄、 mRNA處理或基因表達的其他調控信號。聚腺苷酸尾部被認為在mRNA穩(wěn)定性和啟始翻譯中 起