證純度） 的章狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides)R2 ;在25~30°C，180~250rpm/min搖床中培養(yǎng) 2 ~4d ;
[0019] 2)在作物移栽后15d，每株植株采用灌根法將蕈狀芽胞桿菌R2菌株的發(fā)酵液澆于 植株根部。從移栽日算起，每隔15d用蕈狀芽胞桿菌發(fā)酵液灌根處理，總共灌根3次。每棵 苗灌根菌液20ml (K^CFU/ml，平板計數(shù)，調(diào)節(jié)菌液濃度）。60d后，記錄并計算病情指數(shù)和 防治效果。
[0020] 將含有蕈狀芽胞桿菌（Bacillus myC〇ideS)R2菌株的發(fā)酵液澆灌在植物根部，對 番茄根結(jié)線蟲病有較好防效；其產(chǎn)生的抗蟲活性物質(zhì)對線蟲有驅(qū)避和殺傷作用。
[0021] 本發(fā)明提供了一種蕈狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides)R2菌株制備殺植物根結(jié)線 蟲菌劑中的應(yīng)用，
[0022] 將含有蕈狀芽胞桿菌（Bacillus myC〇ideS)R2菌株的發(fā)酵液作為有效成分，加上 可效用的輔料，制備得到蟲菌劑，將蟲菌劑澆灌在植物根部，對番茄根結(jié)線蟲病有較好防 效；其產(chǎn)生的抗蟲活性物質(zhì)對線蟲有驅(qū)避和殺傷作用。
[0023] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0024] 1、蕈狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides)屬于芽胞桿菌屬。本發(fā)明篩選到一株蕈狀 芽胞桿菌R2菌株對線蟲有較好的抗蟲活性，豐富了芽胞桿菌殺線蟲劑的理論。本研究發(fā) 現(xiàn)蕈狀芽胞桿菌R2菌株產(chǎn)生的N，N-二乙基-間-甲苯酰胺DEET和苯乙烯對線蟲有驅(qū)避 作用，為開發(fā)線蟲驅(qū)避劑及其在線蟲防治中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。闡明病原微生物與宿主 之間的相互關(guān)系及其作用分子機(jī)制，為信息化合物在線蟲生物防治方面的應(yīng)用奠定理論基 礎(chǔ)。
[0025] 2、本發(fā)明中蕈狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides)R2菌株發(fā)酵液誘導(dǎo)番前抗病相關(guān) 防御酶的表達(dá)，使番茄植株對線蟲產(chǎn)生抗性，根結(jié)病癥狀減輕，葉綠素含量顯著高于未誘導(dǎo) 病株。研究結(jié)果豐富了從微生物中分離得到的具有殺線蟲活性的次生代謝產(chǎn)物的理論，同 時也為日后開發(fā)應(yīng)用新的生防農(nóng)藥提供了一定的理論支撐。
[0026] 3、本發(fā)明的蕈狀芽胞桿菌（Bacillus myC〇ideS)R2菌株發(fā)酵液對根結(jié)病有較好的 防治效果。室內(nèi)盆栽實驗，灌根一個月后進(jìn)行采樣，統(tǒng)計調(diào)查結(jié)果為：蕈狀芽胞桿菌R2發(fā)酵 液處理組的防效為90. 23%。表明蕈狀芽胞桿菌R2發(fā)酵液對根結(jié)線蟲的防治有較好的效 果，能有效地抑制根結(jié)的發(fā)病率。由蕈狀芽胞桿菌開發(fā)的生防農(nóng)藥的發(fā)酵原料來源豐富、生 產(chǎn)成本低、無毒安全、無公害。發(fā)酵液施用在田間后，在植物體內(nèi)、土壤和水體中易分解，無 殘留，對環(huán)境無污染，對人畜等非靶標(biāo)生物相對安全，不易產(chǎn)生抗藥性。因此，該產(chǎn)品將具有 十分廣闊的應(yīng)用與市場前景，無論是生產(chǎn)企業(yè)，還是農(nóng)作物種植者都將因此獲得巨大的經(jīng) 濟(jì)效益。
[0027] 4、此外，N，N-二乙基-間-甲苯酰胺（DEET)作為昆蟲驅(qū)避劑，DEET對果蠅的驅(qū)避 機(jī)制有了解，但是對線蟲的驅(qū)避機(jī)制沒有報道，現(xiàn)尚不清楚其對線蟲的驅(qū)避機(jī)制。本研究首 次發(fā)現(xiàn)了 DEET和苯乙烯對線蟲有驅(qū)避作用，為開發(fā)線蟲驅(qū)避劑和殺蟲劑及其在線蟲防治 中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0028]圖1為蕈狀芽胞桿菌R2裝樣量的活性測定示意圖；
[0029] 圖2為蕈狀芽胞桿菌R2發(fā)酵液各萃取相的活性測定示意圖；
[0030] 圖3為抗蟲活性物質(zhì)全波長掃描圖；
[0031] 圖4為抗蟲活性物質(zhì)HPLC示意圖；圖5為HPLC收集各峰的抗蟲活性測定示意圖；
[0032] 圖6為峰2HPLC分離的抗蟲活性物質(zhì)的質(zhì)譜圖；
[0033] 圖7為峰3HPLC分離的抗蟲活性物質(zhì)的質(zhì)譜圖；
[0034] 圖8為苯乙烯的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0035] 圖9為活性物質(zhì)對根結(jié)線蟲的抗蟲活性測定方法示意圖；
[0036] 圖10為DEET對根結(jié)線蟲的抗蟲活性測定示意圖；
[0037] 圖11為苯乙烯對根結(jié)線蟲的抗蟲活性檢測示意圖；
[0038] 圖12為線蟲驅(qū)避性檢測方法示意圖；
[0039] 圖13為覃狀芽胞桿菌R2誘導(dǎo)番前抗性P0D酶活提尚不意圖；
[0040] 圖14為覃狀芽胞桿菌R2誘導(dǎo)番前抗性PP0酶活提尚不意圖；
[0041] 圖中，*表示顯著差異，P〈0. 05 表示極顯著差異，P〈0. 01;
[0042] 圖15為覃狀芽胞桿菌R2誘導(dǎo)番前抗性PAL酶活提尚不意圖；
[0043] 圖中，*表不顯著差異，P〈0. 05 表不極顯著差異，P〈0. 01 ;
[0044] 圖16為番前葉綠素含量提尚不意圖；
[0045] 圖17為番前根系活力提尚不意圖；
[0046] 圖中，*表不顯著差異，P〈0. 05;
[0047] 圖18為盆栽實驗根結(jié)防治效果示意圖；
[0048] 圖中，A.對照9級；B.實驗組1級；C.實驗組0級。
【具體實施方式】
[0049] 為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但 本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實施例。
[0050] 實施例1
[0051] 蕈狀芽胞桿菌R2菌株發(fā)酵液，通過以下步驟制備得到：
[0052] 蕈狀芽胞桿菌R2的培養(yǎng)和最佳裝樣量選擇：
[0053] 用接種環(huán)蘸取保存在甘油中的蕈狀芽胞桿菌R2菌株到LB平板上劃線，活化菌株。 挑取活化的菌落在LB平板上劃線，得到單菌落。將蕈狀芽胞桿菌進(jìn)行液體發(fā)酵，用接種環(huán) 挑取蕈狀芽胞桿菌于LB液體培養(yǎng)基中，在28°C，轉(zhuǎn)速為200rpm/min的搖床中培養(yǎng)24h， 得到蕈狀芽胞桿菌R2種子液。按1 %的接種量將種子液分別接入裝有25ml，50ml，75ml， 100ml，125ml LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28°C，200rpm/min搖床中培養(yǎng)三天。8000rpm/ min，離心5min，棄沉淀，取上清。測定其對秀麗隱桿線蟲的校正致死率，比較不同裝樣量的 抗蟲活性。
[0054]結(jié)果如圖1所示，將R2菌株分別按照25，50，75，100，125ml不同的裝樣量于 200rpm/min，28°C發(fā)酵72h，測定其對秀麗隱桿線蟲的校正致死率，致死率最高的裝樣量即 為最佳裝樣量。從圖中可以看出裝樣量為25ml時其對秀麗隱桿線蟲的校正致死率最高達(dá) 到72. 1 %，說明25ml是最佳的裝樣量，因此25ml作為后續(xù)實驗的裝樣量。
[0055] 實施例2
[0056] 蕈狀芽胞桿菌R2菌株產(chǎn)生的殺線蟲活性物質(zhì)的分離純化：
[0057] 1.極性梯度萃取
[0058] 1)取25mL的蕈狀芽胞桿菌R2菌株發(fā)酵上清液于離心管中，加入等體積的石油醚， 顛倒混勻，8000rpm/min，離心5min。吸取上層的水相于另一離心管中，加入等體積的石油 醚，如此反復(fù)3次，最后將得到的石油醚相收集至一個三角瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的干物質(zhì) 用lmL的生理鹽水重新溶解。
[0059] 2)向剩余的水相中加入等體積的氯仿，顛倒混勾，8000rpm/min，離心5min。吸取 上層的水相于另一離心管中，加入等體積的氯仿，如此反復(fù)3次，最后將得到的氯仿相收集 至一個三角瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的干物質(zhì)，用lmL的生理鹽水重新溶解。
[0060] 3)向剩余的水相中加入等體積的乙酸乙酯，顛倒混勾，8000r/pmmin，離心5min。 吸取上層的有機(jī)相于另一離心管中，向剩余的水相中加入等體積的乙酸乙酯，如此反復(fù)3 次，最后將得到的乙酸乙酯相收集至一個三角瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的干物質(zhì)用lmL的生理 鹽水重新溶解。
[0061] 4)向剩余的水相中加入等體積的正丁醇，顛倒混勻，8000rpm/min，離心5min。吸 取上層的有機(jī)相于另一離心管中，向剩余的水相中加入等體積的乙酸乙酯，如此反復(fù)3次， 最后將得到的正丁醇相收集至一個三角瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的干物質(zhì)，用lmL的生理鹽水 重新溶解。
[0062] 5)將剩余的水相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到的干物質(zhì)用lmL生理鹽水重新溶解。
[0063] 6)檢測提取相的抗蟲活性：將上述萃取得到的石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正 丁醇相、R2發(fā)酵液分別測抗蟲活性。
[0064] 結(jié)果如圖2所示，圖中所示發(fā)酵液和石油醚萃取液對秀麗隱桿線蟲具有較高的校 正致死率，校正致死率分別為98. 05%和86. 35%。而氯仿萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇 萃取相抗蟲活性均較低。說明蕈狀芽胞桿菌R2菌株發(fā)酵液中的抗蟲活性物質(zhì)主要集中分 配在石油醚萃取相部分，判斷其為小極性的物質(zhì)。采用石油醚萃取的方法能夠方便快速地 從發(fā)酵液中提取出抗蟲活性物質(zhì)。
[0065] 2、抗蟲活性物質(zhì)的全波長掃描
[0066] 上述萃取液中，石油醚相具有顯著的抗蟲活性，將石油醚相萃取物用756紫外可 見光分光光度計進(jìn)行全波長掃描，用石油醚溶劑調(diào)零，掃描的波長范圍是190nm~800nm， 并參考圖譜中物質(zhì)最大吸收峰對應(yīng)的波長作為后續(xù)實驗的檢測波長。
[0067] 將石油醚萃取相進(jìn)行全波長掃描，從圖3中可以看出，蕈狀芽胞桿菌R2菌株石油 醚相在210nm處有最大吸收峰，初步推測活性物質(zhì)可能是具有不飽和鍵的化合物，因此選 取210nm作為HPLC的檢測