本發(fā)明涉及莫海維芽胞桿菌的應用及其降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的方法，屬于環(huán)境微生物應用領域。
背景技術：
：鄰苯二甲酸2-乙基己酯(Bison(2-ethylhexyl)ortho-phthalate)，簡稱DEHP，是一類重要的環(huán)境激素類有機合成化合物，在工業(yè)生產(chǎn)中主要用作聚氯乙烯(PVC)塑料增塑劑，提高塑料的可塑性和易彎曲性。塑料中，DEHP與塑料分子以氫鍵或范德華力連接，很容易通過淋洗、遷移或蒸發(fā)等方式進入食物、空氣、飲用水及其它物質(zhì)中；DEHP也可以在塑料生產(chǎn)或燃燒過程中通過煙塵沉降釋放到環(huán)境中。許多動物實驗研究結果顯示DEHP具有生殖發(fā)育毒性、免疫毒性、胚胎毒性、肝臟毒性及致癌性等多種毒性，并具有引起甲狀腺素代謝改變的類雌激素活性。美國環(huán)保局(EPA)、歐盟以及中國國家環(huán)境監(jiān)測中心均已將其列入優(yōu)先控制污染物黑名單。環(huán)境中DEHP的分解、轉(zhuǎn)化方法及技術探索已成為環(huán)境污染治理的重要研究方向。但是DEHP在自然環(huán)境中的水解、光解速度非常緩慢，屬于難降解物質(zhì)。有研究表明，DEHP的水解半衰期達2000年，光解半衰期也需要105年。與水解及光解等物理降解相比，基于微生物代謝的生物降解過程具有功能微生物多樣性、過程簡單、成本低、環(huán)境友好等特點，使得微生物降解被認為是自然環(huán)境中DEHP完全礦化的最有效途徑。因此，篩選高效分解DEHP的微生物并闡明其分解代謝途徑，對于深化有關消除DEHP環(huán)境危害的研究及應用具有現(xiàn)實意義。近年來，DEHP的微生物降解已經(jīng)得到廣泛的研究，大量能高效降解DEHP的菌株已經(jīng)從各類環(huán)境中分離得到，包括紅樹林、土壤、海洋、河流與廢水處理廠的活性污泥等，微生物類別包括大量細菌以及部分真菌。研究表明，不同來源以及不同類型的微生物在DEHP降解途徑方面具有較大差異性，所呈現(xiàn)的降解機制也不盡相同。所述降解機制包括發(fā)揮降解作用的關鍵酶及酶系、降解途徑中的關鍵節(jié)點及關鍵影響因素、微生物自身代謝與降解效果之間的關系、微生物降解廣譜性與特異性及其與DEHP結構的關系等。莫海維芽胞桿菌(Bacillusmojavensis)主要應用在脂肪酶的發(fā)酵，目前未見有關利用莫海維芽胞桿菌降解DEHP的報道。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種能夠降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的新菌株；及該菌株的應用和采用該菌株降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的方法。技術方案本發(fā)明從土壤中篩選并分離出了一株新的菌株；屬于桿狀的革蘭氏陰性菌，能形成芽孢；經(jīng)鑒定，該菌株是一種莫海維芽胞桿菌(Bacillusmojavensis)；命名為莫海維芽胞桿菌B1811；保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；保藏編號為CGMCCNo.12805；保藏時間為2016年7月21日。本發(fā)明的莫海維芽胞桿菌B1811能夠降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯；莫海維芽胞桿菌B1811對鄰苯二甲酸2-乙基己酯的降解率可高達99.1％。采用本發(fā)明的莫海維芽胞桿菌B1811降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的其中一種方法為：在酵母提取物存在的條件下，莫海維芽胞桿菌B1811與DEHP接觸。其中，酵母提取物的量會影響降解率。所以，上述方法，優(yōu)選的，在改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基存在的條件下，莫海維芽胞桿菌B1811與DEHP接觸；所述改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基，每1L中含有以下成分：酵母提取物2-10g，硫酸銨0.5g，氯化鈉4.0g，三水合磷酸鉀0.5g，七水合硫酸鎂0.4g，蒸餾水余量；pH7.0。具體的，是將DEHP加入改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基；將莫海維芽胞桿菌B1811種子液接種于改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基，在150-200rpm、30-35℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)。上述方法，優(yōu)選的，改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基中酵母提取物的含量為6或7g/L。上述方法，優(yōu)選的，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速175rpm，溫度30℃；其他條件相同情況下，此培養(yǎng)條件下鄰苯二甲酸2-乙基己酯的降解率最高。上述方法，莫海維芽胞桿菌B1811種子液相對于改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基的接種量的變化，對單位時間內(nèi)的DEHP降解率有明顯影響；通常情況下，接種量越多，單位時間內(nèi)降解率越高；但是對最終降解率(發(fā)酵液中DEHP含量達到穩(wěn)定時的降解率)沒有明顯影響。上述方法，所述莫海維芽胞桿菌B1811種子液是由莫海維芽胞桿菌B1811培養(yǎng)獲得的。在獲得莫海維芽胞桿菌B1811的條件下，本領域技術人員通過常規(guī)操作即可以獲得莫海維芽胞桿菌B1811種子液。本發(fā)明中，對于某個成分的含量的百分比，如果沒有特別說明，均指重量百分比(w/w)。本發(fā)明所用專業(yè)術語說明：rpm是轉(zhuǎn)速單位，1rpm是指每分鐘旋轉(zhuǎn)一轉(zhuǎn)。有益效果：(1)首次分離培養(yǎng)出能夠降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的莫海維芽胞桿菌B1811；(2)莫海維芽胞桿菌B1811對鄰苯二甲酸2-乙基己酯的降解率超過99.1％；(3)本發(fā)明降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的方法，與本發(fā)明之前細菌、真菌降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的方法相比，在菌種來源上具有新意，降解率高，降解周期短，操作簡單。保藏信息：保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學院微生物研究所保藏日期：2016年7月21日保藏編號：CGMCCNo.12805分類命名：莫海維芽胞桿菌(Bacillusmojavensis)。附圖說明圖1為本發(fā)明中所述莫海維芽胞桿菌B1811的顯微鏡下形態(tài)特征；圖1中，莫海維芽胞桿菌B1811為桿狀的革蘭氏陰性菌，能形成芽孢；圖2為莫海威芽孢桿菌B1811與相關種的16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析；圖3為莫海威芽孢桿菌B1811與相關種的recA序列系統(tǒng)發(fā)育分析。具體實施方式下述實施例中，如無特殊說明，均為本領域常用方法。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1菌株B1811的鑒定菌株B1811分離自土壤，其形態(tài)如圖1所示，屬于桿狀的革蘭氏陰性菌，能形成芽孢。提取其基因組DNA，并利用16srDNA和BCR1引物對于該基因組DNA進行聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，并利用美國國家生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,簡稱NCBI)數(shù)據(jù)庫進行菌株比對。(1)16SrDNA序列分析：16srDNA正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,如SEQIDNO.1所示；16srDNA反向引物1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，如SEQIDNO.2所示；擴增所得16SrDNA序列如SEQIDNO：3所示，序列全長為1461bp。將該擴增所得16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關菌株的基因序列進行比較，用MEGA4.1軟件進行序列比對，采用臨位連接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)1000次隨機抽樣，計算Bootstrap值，所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2。圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap值大于50％數(shù)值，上標的“T”表示模式菌株。從NCBI上可以查出菌株“B1811”與模式菌株BacillusmojavensisRO-H-1T/JH600280同源性達99.8％。(2)gyrB基因序列分析gyrB-34F基因正向引物：5'-ggTgTWRgKgCNgTCgTAAACg-3'，如SEQIDNO.4所示；gyrB-977R基因反向引物：5'-CCSgCAgARTCACCCTCTACg-3'，如SEQIDNO.5所示；擴增所得gyrB基因序列如SEQIDNO：6所示，序列全長為887bp。將該擴增所得gyrB基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關菌株的基因序列進行比較，用用MEGA4.1軟件進行序列比對，采用臨位連接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)1000次隨機抽樣，計算Bootstrap值，所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3。圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap值大于50％數(shù)值，上標的“T”表示模式菌株。從NCBI上可以查出菌株“B1811”與模式菌株B.malacitensisCECT5687(DQ903179)同源性達99.5％。因此可以判定B1811為一種全新的莫海威芽孢桿菌。經(jīng)過鑒定確認其所屬菌種后，莫海威芽孢桿菌B1811于2016年7月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏編號為CGMCCNo.12805；此生物材料已經(jīng)存活試驗測試并通過該試驗。實施例2莫海維芽胞桿菌B1811液體搖瓶培養(yǎng)液制備(1)斜面培養(yǎng)：莫海維芽胞桿菌B1811接種于斜面培養(yǎng)基上，在40℃下培養(yǎng)48小時，得斜面菌株。所用斜面培養(yǎng)基，每1L中含有的成分為：葡萄糖2.0g、蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、瓊脂1.8g、蒸餾水余量，pH為中性，115℃滅菌20min。(2)取斜面菌株接種到已滅菌的種子培養(yǎng)基中，在175rpm、30℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)24h，得到種子培養(yǎng)液。所述種子培養(yǎng)基，每1L中含有的成分為：硫酸銨0.5g、氯化鈉4.0g、三水合磷酸鉀0.5g、七水合硫酸鎂0.4g、瓊脂粉15g、酵母提取物5g、蒸餾水余量，pH7.0，121℃滅菌25min。(3)將10μL的DEHP(工業(yè)純)以無菌操作加入含有50mL的改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基的搖瓶中，將莫海維芽胞桿菌B1811的種子培養(yǎng)液以1mL的接種量接種到搖瓶中，在175r/min、30℃的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)72h；得發(fā)酵液。所述改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基，每1L中含有的成分為：酵母提取物5.0g、硫酸銨0.5g、氯化鈉4.0g、三水合磷酸鉀0.5g、七水合硫酸鎂0.4g、蒸餾水余量，pH7.0，121℃滅菌15min。實施例3DEHP標準曲線制定與含量測定(1)高效液相色譜法(HPLC)制作標準曲線：取600μLDEHP以甲醇為溶劑，制備成1mg/mL的DEHP溶液，稀釋十倍后分別取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL定容至2mL離心管中，即濃度梯度(μg/mL)為10、20、30、40、50、60、70分別用0.45μm有機濾膜過濾后置于液相小瓶中待測。本實施例3中的高效液相檢測條件為：色譜柱為SepaxGp-C18柱(150mm*4.6mm，5.0μm)；流動相為乙腈-水(83：17，V/V)；進樣量10μL；流速1.0mL/min；柱溫25C°；紫外檢測器波長210nm。以DEHP的峰面積為橫坐標，以DEHP的濃度為縱坐標，制作標準曲線；進而獲得峰面積-濃度方程。實施例4高效液相法檢測DEHP的降解率(1)向?qū)嵤├?獲得的發(fā)酵液中加入與發(fā)酵液等量的乙腈對DEHP進行提取，超聲(40KHZ，300W)輔助提取30min后取其中2mL用乙腈定容至10mL，混合均勻后離心(12000rpm,10min)，將離心后的上清液用有機濾膜(0.45μm)進行過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液置于液相小瓶中，以實施例3步驟(1)的檢測條件，采用高效液相色譜儀(HPLC)進行分析。運行時間為20分鐘，讀取保留時間在8.5min左右的峰面積值。根據(jù)實施例3的峰面積-濃度方程，得續(xù)濾液中DEHP的濃度，進而計算出發(fā)酵液中DEHP的殘留濃度。(2)降解率的計算公式：降解率％＝(C0-C)/C0*100％，C0為用莫海維芽胞桿菌B1811降解之前DEHP的總質(zhì)量濃度(μg/mL)(即實施例2步驟(3)發(fā)酵之前搖瓶中混合液的DEHP質(zhì)量濃度：0.1713μg/mL)，C為發(fā)酵液中的DEHP的殘留濃度(μg/mL)。經(jīng)計算，實施例2的降解率為98.9％實施例5莫海維芽胞桿菌B1811降解DEHP的優(yōu)化將實施例2步驟(3)中的種子液接種量依次改為2、3、4、5、6mL，其他操作同實施例2。按照實施例4的步驟測定發(fā)酵液的DEHP濃度，進而計算DEHP的降解率。在不同接種量條件下，DEHP降解率如表1所示。實施例6將實施例2步驟(3)中所用改良BSM基礎鹽液體培養(yǎng)基的酵母提取物的含量依次修改為1、2、3、4、5、6、7、8、10g/L；其他操作同實施例2。按照實施例4的步驟測定發(fā)酵液的DEHP濃度，進而計算DEHP的降解率。在不同酵母提取物的含量條件下，DEHP降解率如表2所示。表1種子液接種量(mL)DEHP降解率(％)00198.9298.1398.9499.1599.0699.1表2<110>北京工商大學<120>莫海維芽胞桿菌的應用及其降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的方法<160>6<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1AGAGTTTGATCCTGGCTCAG20<210>2<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>2AAGGAGGTGATCCAGCC17<210>3<211>1461<212>DNA<213>人工合成<400>3ATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTG60AGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATA120CCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTAC180AGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGC240GTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC300GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGT360GAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCG420AATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAG480CCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAG540GCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACT600GGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA660GATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGC720GAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGT780GCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC840TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT900GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG960ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTC1020GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTA1080GTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTG1140GGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGAC1200AGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCG1260GATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAT1320GCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGT1380AACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGA1440TTGGGGTGAAGTCGTAACAAG1461<210>4<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>4ggTgTWRgKgCNgTCgTAAACg22<210>5<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>5CCSgCAgARTCACCCTCTACg21<210>6<211>887<212>DNA<213>人工合成<400>6AACGCGTTATCAACAGAGCTTGATGTGACTGTTCACCGTGACGGAAAAATCCATCGCCAA60GTCTATAACCGCGGTGTCCCGGTTTCTGATCTTGAGGTTATTGGCGAAACGGATCATACA120GGAACGACTACACACTTTGTTCCAGATCCTGAAATCTTCACGGAAACAACTGAGTATGAA180TATGATTTGCTTGCTAACCGTGTTCGCGAACTAGCCTTTTTGACAAAAGGCGTAAACATC240ACGATTGAAGATAAACGTGAAGGCCAAGAGCGCAAAAATGAGTATCATTACGAAGGCGGA300ATTAAAAGCTATGTAGAGTATTTAAACCGCTCCAAAGAAGTTGTCCATGAAGAGCCGATT360TATATTGAAGGCGAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAGTCGCTCTGCAATACAATGACAGC420TACACAAGCAATATTTACTCATTTACAAACAATATCAACACGTACGAAGGCGGTACCCAC480GAAGCCGGTTTTAAAACGGGGCTGACTCGTGTCATCAATGATTACGCCAGAAAAAAAGGA540CTCATAAAAGAAAATGATCCAAACTTAAGCGGAGATGATGTGAGAGAAGGGCTTACCGCG600ATTATCTCGATCAAACACCCGGATCCGCAGTTCGAAGGCCAAACGAAAACAAAACTAGGC660AACTCAGAGGCGCGGACGATCACAGATACGTTATTTTCTGCTGCGTTGGAAACCTTTATG720CTGGAAAATCCAGATGCGGCCAAAAAAATCGTTGACAAAGGCTTAATGGCAGCAAGAGCA780AGAATGGCTGCGAAAAAAGCGCGTGAATTAACGCGCCGCAAAAGTGCTTTGGAGATTTCA840AACCTTCCTGGTAAATTAGCGGACTGCTCTTCGAAAGACCCGAGCAT887當前第1頁1 2 3