蕈狀芽胞桿菌r2菌株及其在防治植物根結(jié)線蟲病中的應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)微生物學技術(shù)及生物化學與分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，具體地指一種 蕈狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides)R2菌株及其在防治植物根結(jié)線蟲病中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，設(shè)施蔬菜種植面積越來越大。由于倒茬困難， 且復種指數(shù)逐漸提高，根結(jié)線蟲的危害日漸嚴重，發(fā)生區(qū)域不斷擴大，是設(shè)施蔬菜持續(xù)發(fā)展 的主要限制因素之一。根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.)在全世界廣泛分布，寄主范圍廣。 茄科、豆科、萌蘆科蔬菜受根結(jié)線蟲的危害最重，造成的減產(chǎn)損失一般在10%左右，重達 75% (Dicklow et al，1993)。據(jù)調(diào)查，在我國發(fā)現(xiàn)的蔬菜根結(jié)線蟲，主要有南方根結(jié)線蟲 (Meloidogyne incognita)、花生根結(jié)線蟲（M.arenaria)、北方根結(jié)線蟲（M.hapla)和爪唾 根結(jié)線蟲（M.javanica)4個種。在南方4種根結(jié)線蟲都有發(fā)生，在北方溫室大棚主要是南 方根結(jié)線蟲（彭德良，2001)。
[0003] 對根結(jié)線蟲的防治，目前國內(nèi)主要采用化學殺線蟲劑，如氯化苦、溴甲烷、滴滴混 劑、二溴乙烷、二溴丙烷和吸劑呋喃丹、滅線磷、涕滅威和威百畝等?；瘜W藥劑雖然殺蟲快， 效果好，但用量大，成本高，且對人畜劇毒，破壞土壤微生態(tài)環(huán)境（楊文香等，2003)。近年 來，隨著科技的進步和人們環(huán)保意識的加強，生物防治方法引起了人們的高度重視，將逐漸 成為綜合防治的重要手段之一。資料報道，線蟲天敵主要有真菌、細菌、病毒、立克氏體、放 線菌、捕食性線蟲等，將真菌和細菌作為生防因子的報道較多（汪來發(fā)等，2002)。
[0004] 從天然資源中尋找和發(fā)現(xiàn)具有殺線蟲活性的化合物，是研發(fā)環(huán)保生物殺線蟲劑的 重要途徑。目前，從微生物和植物中分離得到的具有殺線蟲活性的次生代謝產(chǎn)物已有200 多個，這些活性代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型多種多樣，包括萜類、肽類、大環(huán)內(nèi)酯類、生物堿類、雜環(huán) 類、甾醇類、醌類、炔類、簡單芳香類、脂肪酸類、木脂素類、神經(jīng)酰胺類、preussomerin類和 哌嗪類等（Niu et al.，2009)。1981 年，Hayashi 等（Hayashi et al.，1981)從乳白耙齒 菌中分離出二氧烷基化氫醌，其對稻桿尖線蟲的ED50是25mg/L。Zuckerman等（Zuckerman et al.，1996)報道了一株黑曲霉在實驗室、溫室和大田試驗中對南方根結(jié)線蟲都具有較 強的毒殺活性，鑒定該菌培養(yǎng)液中含有檸檬酸、草酸等。May er(Mayer et al.，1999)和 Stemer(Stemer et al.，1997)從奧爾類臍燕的發(fā)酵液中分離到環(huán)十二縮肽omphalotin A， 它是具有很大的商業(yè)價值的次級代謝物，對南方根結(jié)線蟲的殺蟲活性高于目前廣普遍使用 的阿維菌素，但由于得率太低而不能實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
[0005] 秀剛隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans)生存于復雜的土壤環(huán)境中，具備了結(jié)構(gòu) 簡單但功能完善的神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是其發(fā)達的化感體系，使其成為研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和相 關(guān)行為的重要模式生物。線蟲的化感神經(jīng)元主要集中在頭部，共12對，均具有纖毛結(jié)構(gòu)， 線蟲通過這些化感神經(jīng)元可檢測環(huán)境中多種化學物質(zhì)及環(huán)境條件。例如線蟲可檢測揮發(fā) 性、水溶性等物質(zhì)，以及溫度、氧濃度和pH等環(huán)境條件，而這些信號往往是與食物、危險等 環(huán)境因子聯(lián)系在一起。線蟲以這些信號為線索，判斷環(huán)境利害，產(chǎn)生趨化、逃避等一系列的 應激行為。在線蟲的化感應激行為中，由其嗅覺神經(jīng)元介導的對揮發(fā)性物質(zhì)的檢測和應答 反應最為迅速，這也是它尋找、追蹤食物，遠離病原菌和危險環(huán)境的最佳工具。除了食物性 細菌可以產(chǎn)生吸引線蟲的物質(zhì)外，最近的研究表明，許多病原微生物也能對線蟲產(chǎn)生強烈 的吸引，包括常見的病原細菌銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa)和粘質(zhì)沙雷氏菌 (Serratia marcescens)等。線蟲對揮發(fā)物質(zhì)的檢測主要依賴于嗅覺神經(jīng)元，其中檢測吸引 性的揮發(fā)物質(zhì)主要依賴于神經(jīng)元AWA和AWC，而感知驅(qū)避性揮發(fā)物質(zhì)如驅(qū)避劑2-壬酮的主 要為 AWB 神經(jīng)元（Troemel et al.，1997) 〇
[0006] DEET也是人工合成的應用最廣泛的昆蟲驅(qū)避劑（Katz et al.，2008)，報道其對 蚊、蠓、白蛉及蚋有良好的驅(qū)避效果，對虻、蜱、螨、旱螞蝗驅(qū)避效果一般。DEET是很多驅(qū)避 花露水中的有效成分，驅(qū)避效果迅速，有效驅(qū)避時間4~8h不等，且毒性低，幾乎不污染環(huán) 境。研究發(fā)現(xiàn)果蠅和蚊通過嗅覺神經(jīng)元感知DEET的驅(qū)避作用，識別DEET的嗅覺受體蛋白 為 0R83b (Mathias et al.，2008 ;Syed and Leal, 2008)。苯乙烯用于有機合成，具有揮發(fā) 性。然而，對于這兩種物質(zhì)對線蟲的驅(qū)避機制未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是提供一種蕈狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides)R2 菌株及其在防治植物根結(jié)線蟲病中的應用。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種蕈狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides) R2菌株，其保藏編號為CCTCC NO :M 2015251。本發(fā)明所提供的蕈狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides)R2菌株經(jīng)16S rRNA分析和其他形態(tài)學等分析，確定該菌株為蕈狀芽胞桿菌 (Bacillus mycoides)，其命名為章狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides) R2,該菌種已于2015 年4月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC);保藏登記號為CCTCC NO :M 2015251 ;保藏地點為：中國、武漢、武漢大學。
[0009] 進一步，所述蕈狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides)R2菌株發(fā)酵的發(fā)酵液中含有具 有抗蟲活性物質(zhì)的N，N-二乙基-間-甲苯甲酰胺和苯乙烯。
[0010] 1、蕈狀芽胞桿菌（Bacillus, mycoides) R2的菌學特征：
[0011] 蕈狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides) R2菌體革蘭氏陽性，長桿狀，菌體大小1~ 1.2以111\2.7~3.6以111，具圓端，鏈狀排列。中生芽孢，且芽孢橢圓形，孢囊不膨大。在1^平 板上形成米白色的菌落，菌落直徑3~5mm，菌落表面粗糙、卷曲、邊緣有毛狀突起，不隆起， 不透明，37°C生長明顯快于28°C。
[0012] 2、N，N-二乙基-間-甲苯甲酰胺（DEET)和苯乙稀，通過以下步驟制備得到：
[0013] 蕈狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides)R2菌株的發(fā)酵液，離心后收集上清液。上清液 按極性從小到大、以1 : 1的比例，分別與石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行逐步萃取，取 各萃取相濃縮后進行抗蟲活性測定，將有活性的萃取相通過HPLC進一步分離純化，LC-MS 分析確定活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，在活性分析后，對有活性的物質(zhì)進行真空冷凍干燥進行濃縮，即 得抗蟲活性物質(zhì)N，N-二乙基-間-甲苯酰胺和苯乙烯；具體步驟如下：
[0014] 首先要先測試蕈狀芽胞桿菌R2菌株發(fā)酵的最佳裝樣量，將保存的蕈狀芽胞桿菌 R2菌株在LB平板培養(yǎng)基上進行活化后，用接種環(huán)挑取單菌落分別接入裝有25ml、50ml、 75ml、100ml、125ml LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 °C，200rpm/min搖床中培養(yǎng)三天。 8000rpm/min，離心5min，棄沉淀，取上清。
[0015] 測定其對秀麗隱桿線蟲的校正致死率，比較不同裝樣量的抗蟲活性。秀麗隱桿 線蟲致死率的測定：在96孔細胞培養(yǎng)板中每個孔里依次加入5 y 15-氟尿嘧啶（12. 5mg/ L)，3 y 1氯霉素，1 y 1鏈霉素，200 y 1 R2上清液，最后加入30條生長狀態(tài)相當且處于L4 期的秀麗隱桿線蟲，每個處理設(shè)三個重復。24h后觀察并計算秀麗隱桿線蟲致死率，致死 率最高的裝樣量即為最佳裝樣量；采用最佳裝樣量進行發(fā)酵，3d后得到發(fā)酵液，發(fā)酵液于 8000rpm/min，離心5min，棄沉淀，取上清。上清液按極性從小到大、以1:1的比例，分別與石 油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行逐步萃取，取各萃取相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用lml無菌水溶解旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)的物質(zhì)，濃縮后進行抗蟲活性測定；將有活性的萃取相濃縮液做HPLC，每次上樣量為 25 y 1，流速0. 5mL/min，10 % -80 %乙腈為流動相，將HPLC洗脫曲線各峰值的組分分別收集 并進行活性檢測；將HPLC洗脫曲線峰值中檢測有活性的相對應的組分進行LC-MS分析，上 樣量為25 y 1，流速0. 5mL/min，10% -80%乙腈為流動相，對活性峰經(jīng)質(zhì)譜解析，經(jīng)meplin 數(shù)據(jù)庫檢索，和相關(guān)標準圖譜的對比分析，可以確定活性物質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)，確定抗蟲活性物 質(zhì)為N，N-二乙基-間-甲苯酰胺和苯乙烯。
[0016] 本發(fā)明提供了一種蕈狀芽胞桿菌（Bacillus myC〇ideS)R2菌株在防治和殺滅植物 根結(jié)線蟲中的應用。
[0017] 包括以下步驟：
[0018] 1)將所述的蕈狀芽胞桿菌（Bacillus myC〇ideS)R2菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵 液；其中，25ml的LB液體培養(yǎng)基（250ml三角瓶）中接種單菌落（單菌落是為了保