抑肽酶衍生的多肽-抗體綴合物的制作方法
【專利說明】抑化酶衍生的多化-抗體綴合物
[000。 相關(guān)申請的引用
[0002] 本申請要求于2012年11月12日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/725, 365的優(yōu)先 權(quán)日的權(quán)益。運個早期提交的臨時申請的內(nèi)容W其全部內(nèi)容結(jié)合于本文中作為參考。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及其中一種或多種Kunitz型蛋白酶抑制劑（例如，抑膚酶酶）或其衍生 物（例如，抑膚酶衍生的多膚）W本文中的方式綴合至抗體部分的蛋白綴合物；綴合物藉此 合成用于藥物用途或診斷用途（例如，用作成像試劑）的方法；包含它們的生理可接受組合 物；W及將綴合物給藥于患者用于，例如，癌癥和神經(jīng)功能障礙的診斷和治療的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 盡管血腦屏障度BB)保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CN巧不受有害物質(zhì)（例如，意外攝入毒 素）侵害，但它也阻止治療性蛋白接近大腦和脊髓，因此，在治療CNS的病癥中設(shè)置了主要 障礙。一般來說，僅僅小于約500道爾頓的親脂分子穿過BBB。許多在CNS疾病的動物研究 中表現(xiàn)出有前景結(jié)果的藥物都比此大得多，而蛋白治療劑通常由于腦毛細(xì)血管內(nèi)皮壁對那 種尺寸和復(fù)雜性的藥物的滲透性可W忽略不計而一般從中樞神經(jīng)系統(tǒng)排除。
[0005]目前增強蛋白質(zhì)治療劑遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的策略能夠分為=類。第一類包括創(chuàng) 傷性方案，如藥物的直接腦室內(nèi)給藥和暫時中斷BBB的高滲性溶液內(nèi)頸動脈灌注。第二類 包括旨在通過BBB提高蛋白質(zhì)脂溶性的藥理學(xué)基的策略。在第S類中是遞送方案，其中治 療劑連接于一種相對于BBB起到載體或受體-祀向的遞送載體作用的蛋白。運種方法的優(yōu) 點在于，它是高度特異性的和高效的，導(dǎo)致不利影響最小，并且適用廣泛。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 在第一方面中，本發(fā)明特征在于包含抗體部分和一種或多種Kunitz型蛋白酶抑 制劑（例如，抑膚酶）或其衍生物（例如，抑膚酶衍生的多膚）的蛋白綴合物?？贵w部分和 將綴合物傳送通過BBB的多膚二者都將在W下進行詳細(xì)討論。蛋白綴合物能夠通過接頭的 內(nèi)含物；通過綴合至每一抗體部分的多膚的數(shù)目；和/或通過抗體部分和多膚發(fā)生綴合的 位置進一步定義。而且，在給定的綴合物中，在含有不只一個多膚的情況下，每個多膚僅僅 連接至抗體部分。換句話說，沒有多膚經(jīng)由接頭或另外方式連接至綴合物中的另一多膚。
[0007] 在一個實施方式中，蛋白綴合物包含抗體部分和包含氨基酸序列化ri-Phe2-Phe3- TyrA-Glys-Glye-Cysy/Sery-Ar邑s-Glyg-Lysi〇-Ar邑ii-Asni2-Asni3-Phei4-Lys巧一Thrie-Glun-Glui 片>'19佛9 10歌117)或生物活性類似物或569 10歌117的片段的多膚。正如由"切37/Ser/'所示，在位置7的氨基酸殘基能夠是半脫氨酸或絲氨酸。在包含運種多膚（SEQID NO: 117)或任何其它本文中的多膚的蛋白綴合物中，抗體部分能夠在多膚的一個或多個W 下位置綴合至多膚：N-端氨基酸殘基（例如，T虹1，其中多膚由SEQIDN0:117組成）；C-端 氨基酸殘基（例如，Tyrw其中多膚由SEQIDNO: 117);或N-端和C-端之間的賴氨酸殘基 (例如，沈QIDNO: 117 中的Lysi。或Lys15)。
[0008] 我們使用術(shù)語"蛋白質(zhì)綴合物"是指由分子禪合部分形成的氨基酸基化合物。在 本發(fā)明中，部件包括抗體部分和由其（例如，通過接頭）禪合的一個或多個多膚。"氨基酸 基的化合物"是指主要包括，但不一定完全是氨基酸殘基的化合物（即，僅包含氨基酸殘基 (如在常規(guī)融合蛋白中的情況）的化合物或包含氨基酸殘基和其它構(gòu)件的化合物）。正如 上面所提及，蛋白綴合物能夠包含接頭，其可W是化學(xué)化合物。運種綴合物將主要包括，但 非唯一地是，氨基酸殘基，因為抗體部分與多膚是由氨基酸構(gòu)成而接頭是化學(xué)化合物。蛋白 綴合物還可W包括檢測劑（例如，巧光體、放射性同位素、染料等）?？蓹z測的試劑可W不包 括氨基酸殘基，W及在運種情況下，我們也可W是指一種含有運些檢測劑作為氨基酸基化 合物的蛋白綴合物。本發(fā)明還涵蓋在診斷方法，包括診斷成像中使用可檢測的綴合物的方 法。
[0009] 為了更加清楚起見，我們注意到，抗體部分與一個或多個多膚彼此區(qū)別（即，它們 是彼此不相同的）。然而，任何蛋白質(zhì)綴合物能夠包括不只一個多膚，而兩個、=個、四個或 更多個多膚可W是相同的（即，可W具有相同的氨基酸序列）或可W彼此不同（即，綴合至 抗體部分的多膚可W有不同的氨基酸序列）。關(guān)于本發(fā)明的組合物和方法，我們使用了術(shù) 語"包含"意指"含有"。例如，在W上的實施方式中，蛋白綴合物包含抗體部分和依次含有 由SEQIDNO: 117表示的氨基酸序列的多膚。在任何情況下，除非上下文另外特別指明，否 貝1J，本發(fā)明的組合物，其組成部分（例如，抗體部分和多膚）和本發(fā)明的方法能夠包含所引 述的要素或步驟或由其組成。例如，給定的多膚能夠包含所引述的序列（例如，SEQIDNO: 117)或由所引述的序列組成。
[0010] 正如W上所示，本發(fā)明的蛋白綴合物能夠包括如本文的多膚或生物活性類似物或 其片段。我們關(guān)于蛋白綴合物的多膚部分使用了術(shù)語"生物活性"是指所引用的多膚的類 似物或片段在有用的生理設(shè)置中保留了足夠活性。由于蛋白綴合物的多膚部分負(fù)責(zé)傳送綴 合物和/或多膚連接的抗體部分穿過BBB，則所引述的多膚的類似物或片段在其有能力傳 送綴合物和/或多膚連接的抗體部分穿過BBB時也是生物活性的。運個屬性能夠在體內(nèi)或 體外模型中進行測試，而所引述的多膚的生物活性類似物和片段可能在此轉(zhuǎn)運中比引述的 多膚更加有效或不太有效。具體而言，片段或類似物只要它保持足夠高活性而實現(xiàn)所需結(jié) 果（例如，只要其中包含的綴合物實現(xiàn)臨床上有益的結(jié)果）時其功效可W比所引述的多膚 功效低。
[0011] 所引述多膚的"片段"是所引述多膚的連續(xù)或緊鄰部分（例如，多膚十個氨基酸長 的片段能夠是那個多膚中任意2-9個近鄰殘基（contiguousresi化es))。所引述多膚的 "類似物"是具有類似于，但不相同于所引述多膚或其部分之序列的序列的任何多膚。因此， 包含一個或多個氨基酸取代、插入或氨基酸殘基的缺失（或其任何組合）的多膚就是所引 述序列的類似物。適合包含于本發(fā)明蛋白綴合物中的多膚的片段和類似物進一步描述如 下。
[0012] 如所示，本發(fā)明的任何蛋白綴合物能夠包括綴合物的抗體部分和一個或多個多膚 之間的接頭。綴合物能夠通過本領(lǐng)域內(nèi)已知為"點擊化學(xué)（clickchemis付y)"的方法進行 組裝?；蛟S點擊反應(yīng)的最突出的實例是銅-催化的疊氮化物-烘環(huán)加成反應(yīng)（CuAAC)，而 該反應(yīng)能夠用于生成本發(fā)明的綴合物。運些反應(yīng)在體內(nèi)是有用的，因為疊氮化物或端烘官 能團通常都存在于自然系統(tǒng)中。盡管基于CuAAC的點擊化學(xué)具有引人入勝的特點，但銅可 能阻礙活體細(xì)胞或整個生物內(nèi)的生物正交綴合，而本發(fā)明的方法也能夠采用無銅點擊化學(xué) (即，本發(fā)明本綴合物能夠采用無銅點擊化學(xué)進行組裝）。
[0013] 在一些實施方式中，接頭是包含與伯胺具有反應(yīng)活性的基團的化學(xué)化合物。因此， 接頭能夠是單氣化環(huán)辛烘（MFC0)、雙環(huán)化1. 0]壬烘度CN)、N-班巧酷亞胺基-S-乙酷基 硫代乙酸醋（SATA)、N-班巧酷亞胺基-S-乙酷基硫代丙酸醋（SATP)、馬來酷亞胺或二苯并 環(huán)辛烘值BC0)。合適的接頭和將其引入本發(fā)明的綴合物中的方法W下進一步進行描述。
[0014] 在由SEQ ID NO: 117表示的多膚中，在編號位置7處的殘基能夠是半脫氨酸殘基 或絲氨酸殘基，而運種取代能夠在本文中的任何多膚中進行。因此，有用的多膚能夠包括氨 基酸序列化Ti-Phe2-Phe3-Tyr4-Gly5-Gly日-切S7-Args-Glyg-Lysin-Argii-Asni2-Asni3-Phei4-Ly S巧虹i6-Glui7-Gluis-Ty；Tig(SEQ ID NO:67)，氨基酸序列虹 1-Phe2-Phe；5-Tyr4-Gly5-Gly6-Se fy-Ar邑8-G1y9-Lysi〇-Ar邑u-Asni2_Asni3-Phe"-Lys巧一Thrie-Glun-Gluis-Tyrig (SEQ ID N0:97)， 或由SEQ ID N0:67或SEQ ID N0:97表示的多膚的生物活性片段或類似物。為了易于閱讀， 我們在每個可能情況下將不會重復(fù)短語或其生物活性片段或類似物。應(yīng)該理解的是在所引 述多膚是有用的情況下，生物活性片段或其類似物也是有用的。
[0015] 在蛋白綴合物包括SEQIDNO: 117的類似物，該類似物能夠含有至少13個相對 于SEQIDNO: 117是無變化的氨基酸殘基（例如，13-19個氨基酸殘基，包括13和19個在 內(nèi)）。由于類似物可W包括其它氨基酸殘基，則類似物可W比SEQIDNO: 117的19個氨基 酸殘基長。無論長度或是差異的精確本質(zhì)，相似度能夠表達為類似物的序列和所引述的多 膚（本文中，SEQIDN0:117)的序列之間的"同一性百分比"。按照運種方式表征的類似物 進一步在W下進行描述。在多膚是SEQIDNO: 117的類似物的任何情況下，在編號位置10 的賴氨酸殘基和/或編號位置15的賴氨酸殘基能夠保持不變。目P，類似物能夠在位置10 處和/或在位置15處包含賴氨酸殘基。本領(lǐng)域的普通技術(shù)員將會意識到，給定殘基的絕對 位置可W在某些情況下進行變化。例如，如果類似物包含多于或少于SEQIDNO: 117的第9 個氨基酸殘基，則剛才提及的賴氨酸殘基將會出現(xiàn)在等同于位置10和/15的位置。例如， 在N-端包含一個其它氨基酸殘基的類似物中，在所引述的序列的位置10和15處的賴氨酸 殘基將會出現(xiàn)在類似物的位置11和16處。
[0016] 在沈QIDNO: 117的其它類似物中，Asni2能夠用Gin取代，Asn13能夠用Gin取代， 和/或化614能夠用了7'或1'巧取代。在569 10^:117的其它有用的類似物中，半脫氨酸 殘基加入到多膚的氨基和/或簇基端的末端。無論位置是SEQIDNO: 117的位置1上的蘇 氨酸殘基，SEQIDNO: 117的位置19上的酪氨酸殘基，或是從多膚的氨基-和/或簇基端 末端缺失一個或多個殘基產(chǎn)生的殘基內(nèi)部的殘基，半脫氨酸殘基都能夠加在端位置上。換 言么N-和/或C-端半脫氨酸殘基能夠添加到全長多膚或其片段或類似物上。有用的類 似物能夠包括序列：Phe3-Tyr4-Gly日-Glye-切Sy/Sery-Args-Glyg-LysiD-Argii-Asniz-Asnis-Ph ew-Lysi日-T虹le-Glun-Gluis-Tyr"-切S(沈QIDN0:118) ;Gly日-Glyg-Ser^-Args-Glyg-Lysio-A rgu-Asni2-Asni3-Phei4-Lysi5_T虹le-Glu口-G1Uis-Tyr。-切s(SEQIDN0:119) sSer^-Arg廠G1 y廠Lysi〇-Argii-Asni2-Asni3-Phei4-Lysi5-T虹i6_G1u口-Glui廠Tyr。-切s (沈QIDN0:120);Glyg -Lysi〇-Argii-Asni2-Asni3-Phei4-Lysi日-T虹ig-Glun-Gluis-Tyrig-切s(SEQIDN0:121);或Lys i〇-Argii-Asni2-Asni3-Phei4-Lysi日-Tyr。-切s(沈QIDN0:122)。我們已經(jīng)對我們已有的氨基 酸殘基進行了編號而使之在類似物如何設(shè)及SEQIDNO: 117時更加顯而易見。例如，化63是SEQIDNO: 117的第S氨基酸殘基，但是，顯而易見是，由SEQIDNO: 118表示的SEQID NO: 117的類似物中的第一氨基酸殘基。
[0017] 在蛋白綴合物包含SEQIDNO: 117的片段的情況下，片段能夠包含SEQIDNO: 117 的至少6個（例如，6~18,包括6和18個在內(nèi)）近鄰氨基酸殘基。例如，片段能夠包括或 包含序列Lysi〇-Argii-Asni2-Asni3-Phei4-Lysi日（SEQIDNO:。3)。
[0018] 在任何實施方式中，多膚能夠包括W D-形式、k形式，或運兩種形式的氨基酸殘 基。例如，一個或多個（并高達全部的殘基）能夠是形式或D-形式。
[0019] 關(guān)于蛋白綴合物的構(gòu)型，綴合物能夠包括一個抗體部分和，與其連接的，不同數(shù)目 的多膚。多膚的數(shù)目將由抗體部分上合適的連接點的數(shù)目決定。由于本文中的接頭能夠與 伯胺基團反應(yīng)，則接頭可W在抗體部分中的一個或多個賴氨酸殘基處將多膚連接至抗體部 分。另外，接頭也可W與抗體部分上的琉基基團或糖類基團反應(yīng)（而因此與之連接）。接頭 可W定位于少至1-10個賴氨酸殘基（即，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個多膚能夠綴合于抗體 部分的明顯不同的賴氨酸殘基處。在具體的實施方式中，約15 (例如，14-16)、約30、約40、 約50、約60、約70、約80或約90個賴氨酸殘基可W占據(jù)。綴合物中的多膚數(shù)目也能夠表示 為抗體部分中可用于綴合的殘基數(shù)目的百分?jǐn)?shù)。更具體而言，約10%至高達100%的賴氨 酸殘基能夠綴合至多膚。
[0020] 在任何實施方式中，抗體部分能夠是IgG的類別。在任何實施方式中，抗體部分能 夠是四聚體抗體，單鏈抗體（scFv)，四聚體抗體的片段（例如，F(xiàn)ab片段、F(ab')2片段）或 任何運些抗體部分的生物活性變體。我們關(guān)于蛋白綴合物的抗體部分使用了術(shù)語"生物活 性的"是指抗體的變體保持了有用的生理設(shè)置中的足夠活性。由于蛋白綴合物的抗體部分 選擇性地結(jié)合生物祀，所引述的抗體部分的變體，當(dāng)其有能力選擇性地結(jié)合祀至有用程度 時，則是生物活性?？贵w部分的生物活性變體對生物祀（例如，細(xì)胞受體）可W具有與所引 述的抗體部分不同的親和性。親和力只要其維持足夠高而實現(xiàn)所需的結(jié)果（例如，只要包 括它的綴合物獲得臨床受益的結(jié)果），則可W比所引述的抗體部分的更低。
[0021] 抗體部分能夠是人的、嵌合的或人源化的抗體部分或其生物活性變體。為了易于 閱讀起見，我們將不會在每個場合下都重復(fù)短語"或其生物活性變體"。應(yīng)該理解的是，抗 體部分適用于本發(fā)明的上下文中，其生物活性變體也是有用的。抗體部分能夠是單克隆抗 體或多克隆抗體，由單克隆或多克隆抗體構(gòu)建的單鏈抗體、或單克隆或多克隆抗體的片段 (例如，F(xiàn)ab或F(ab'）2片段）。
[0022] 關(guān)于祀，抗體部分（例如，四聚體抗體、其生物活性變體、scFv、F油片段或F(油'）2 片段，或其生物活性變體，無論類別（即，無論是IgG類別或其它類別）和是否是人的、人源 化的、嵌合的、單克隆的或具有本文中的任何其它屬性或特性）能夠特異性地結(jié)合生長因 子受體或細(xì)胞因子受體（例如，白細(xì)胞介素受體）。生長因子受體能夠是通過表皮生長因子 巧G巧家族的成員結(jié)合的受體。對于EGF家族中的蛋白的受體實例包括EGF受體巧GFR)、 肝素結(jié)合的類EGF生長因子受體化B-EGFR)、雙調(diào)蛋白受體（AR)、表皮調(diào)節(jié)素受體巧PR)、 巧igen受體、P細(xì)胞素受體、和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白的受體（例如，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋 白-2、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3、或神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4的受體）。盡管本發(fā)明并未如此限制，但當(dāng)EGFR 被祀向時，抗體部分能夠是曲妥珠單抗，西妥昔單抗，或帕尼單抗，含有曲妥珠單抗、西妥昔 單抗或帕尼單抗的重鏈和輕鏈的可變域的scFv，或運些四聚或單鏈抗體的生物活性變體。 例如，曲妥珠單抗、西妥昔單抗、或帕尼單抗的Fab或F(ab' )2片段。我們已經(jīng)對具有與曲 妥珠單抗具有約99%同源性的序列的抗體進行了研究