活疫苗制備
【專(zhuān)利說(shuō)明】活疫苗制備
[0001] 本發(fā)明提供了用于生成含有穩(wěn)定細(xì)菌的活疫苗的方法，W及通過(guò)所述方法獲得的 含有細(xì)菌的疫苗，所述穩(wěn)定細(xì)菌攜帶至少=個(gè)減毒突變。
[0002] 活細(xì)菌疫苗中的許多包含已通過(guò)生物分子技術(shù)操作的減毒細(xì)菌。不幸的是，出于 下述原因，該些疫苗中的大多數(shù)視為不足W順應(yīng)實(shí)踐需要： (a) 生產(chǎn)是復(fù)雜和耗時(shí)的，減毒程度不能得到控制，并且相應(yīng)地對(duì)宿主敏感性的適應(yīng)通 常是不能令人滿(mǎn)意的。 (b) 通過(guò)立法機(jī)構(gòu)要求的測(cè)試方法(臨床試驗(yàn)）也是復(fù)雜的。 (C)待接種疫苗的群體是有限的。
[0003] 相比之下，通過(guò)代謝漂移（MD)減毒的突變體的特征在于下述優(yōu)點(diǎn)： (a) 制備成本很低，并且經(jīng)由增加的世代時(shí)間的所需選擇的減毒程度和因此各自降低 的菌落大小原則上幾乎是任意的。 (b) 當(dāng)使用具有S個(gè)減毒MD突變的穩(wěn)定特異性疫苗株用于農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物的疫苗接種時(shí)，不 需要精細(xì)的測(cè)試方法。 (C)將取得甚至更小的批量大小。
[0004] 關(guān)于MD減毒的進(jìn)化原則的關(guān)鍵數(shù)據(jù)，應(yīng)強(qiáng)調(diào)下述： (a) 致病因子相對(duì)于宿主的相互影響基于相互耐受。當(dāng)偶然由高度有毒力的致病因子 的減毒突變體感染時(shí)，高度敏感的宿主作為單一個(gè)體而存活。宿主群體經(jīng)由少數(shù)存活個(gè)體 而恢復(fù)活力。致病因子作為適應(yīng)的減毒株而增殖。多發(fā)性粘液瘤病是此類(lèi)過(guò)程的典型例子。 結(jié)論；細(xì)菌群體及真菌和病毒的群體）始終含有逐漸減毒的突變體，尤其是所謂的MD突 變體。 (b) 根據(jù)定義MD突變體代表在代謝區(qū)室中具有突變的克隆，導(dǎo)致功能障礙（即減毒= 適合度代價(jià))。因此，可W發(fā)現(xiàn)與野生株相比較逐步降低的菌落大小(取決于克隆)。正常地， 該些突變體通過(guò)免疫活性宿主消除，或可替代地，被適應(yīng)的正常菌群生長(zhǎng)超過(guò)。 (C)MD突變體的菌落大小降低與(延長(zhǎng)的）世代時(shí)間和(增加的）減毒程度反相關(guān)。 (d)MD減毒測(cè)試疫苗和疫苗令人信服的功效已得到證明。
[0005] MD突變體可W作為下述選擇且分離： (a) 例如鏈霉素、利福平、磯霉素、夫西地酸、蒙晚酸的自發(fā)MD抗生素抗性（MD"res") 克隆。該些克隆可與劇毒抗性克隆有關(guān)超過(guò)1%的頻率分離。MD"res"和有毒力的抗 性克隆起因于不同突變。相應(yīng)地，MD"res"和減毒可W視為功能實(shí)體。 (b) 在"相繼死亡"培養(yǎng)物中的間接累積的環(huán)境應(yīng)激耐受力（iet)增加的突變體。 (C)衍生自鏈霉素依賴(lài)性（Smd)克隆的鏈霉素不依賴(lài)性（Sm-id)抑制基因突變體。該 兩種標(biāo)記突變體由廣譜克隆組成，所述廣譜克隆的特征在于特別的逐漸降低的菌落大小W 及分別從幾乎野生型毒力到過(guò)度減毒(微型菌落）的漸增減毒程度的克隆。一般地，核糖體 突變或多或少增加正常錯(cuò)讀(錯(cuò)譯)，并且唯一的抑制突變也引起減毒。
[0006]對(duì)于例如雞群體用活的沙口氏菌屬（皿we77a)和彎曲桿菌屬（<方聲>_77(9知 疫苗的免疫接種，對(duì)人類(lèi)的感染鏈的中斷和因此人腸炎的降低是主要目標(biāo)。通常，雞耐受兼 性致病性沙口氏菌屬巧日甚至一般的彎曲桿菌屬)，而不顯示任何臨床癥狀。因此，該些野生 株對(duì)于雞的低毒力要求疫苗株顯示中等程度的減毒，一方面確保對(duì)于雞的免疫原性，但另 一方面排除對(duì)于人類(lèi)的危害。
[0007] 疫苗株功效的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是例如在攻擊后能證實(shí)的建群程度的降低。甚至對(duì)于彎曲 桿菌屬，表達(dá)細(xì)菌的所有組分(例如外膜蛋白質(zhì))的MD減毒的活疫苗也可W視為實(shí)踐導(dǎo)向選 項(xiàng)。
[0008] 因此，能夠開(kāi)發(fā)用于兼性致病菌例如沙口氏菌屬和彎曲桿菌屬的有效疫苗，條件 是通過(guò)調(diào)整至低或中等減毒程度來(lái)避免過(guò)度減毒。換言之，作為減毒等價(jià)物的菌落大小降 低不應(yīng)降至低于野生株菌落大小的約25%。另外，該種必要條件必須與機(jī)陽(yáng)的安全要求一 致；由于存在兩個(gè)獨(dú)立的減毒突變的穩(wěn)定性?；貜?fù)率/標(biāo)記為約lOA然而，存在開(kāi)發(fā)疫苗 株的需要，所述疫苗株顯示甚至更高的穩(wěn)定性，即更低的回復(fù)率，而不是過(guò)度減毒。不幸的 是，引入另外突變W增加活疫苗的安全性通常導(dǎo)致過(guò)量減毒，由此致使疫苗較不有效。
[0009] 因此，本發(fā)明基礎(chǔ)的技術(shù)問(wèn)題是提供特征在于穩(wěn)定性增加的改良活疫苗株。所述 技術(shù)問(wèn)題的解決方案通過(guò)提供權(quán)利要求中表征的實(shí)施方案來(lái)實(shí)現(xiàn)，即提供基于至少=個(gè)突 變的穩(wěn)定性增加的改良活疫苗株，然而避免過(guò)度減毒且允許將減毒調(diào)整至所需水平。事 實(shí)上，在導(dǎo)致本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)期間，可W顯示通過(guò)使用MD減毒，可W生成特征在于S個(gè)(或 甚至更多個(gè)）獨(dú)立減毒突變的疫苗株，其顯示增加的穩(wěn)定性且減毒程度不超過(guò)具有兩個(gè)MD "res"減毒突變的疫苗株的減毒程度。在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中使用鏈霉素，然而，本發(fā)明中公開(kāi) 的操作并不僅限于該抗生素。下文描述的實(shí)驗(yàn)基于衍生自Smd突變體的所謂的Sm-id克隆 的使用，因?yàn)樵撔?雙重標(biāo)記"突變體(包含顯示從野生株樣菌落到微型菌落的所有減毒程 度的克?。┰试S生成疫苗株，其顯示的減毒程度對(duì)應(yīng)于MD"res"單一標(biāo)記株的減毒程度。 本發(fā)明的菌株（Sm-id/MD"res")顯示約1(T24的穩(wěn)定性增加。
[0010] 迄今為止，沙口氏菌屬和彎曲桿菌屬的Sm-id/MD"res"疫苗株在現(xiàn)有技術(shù)中仍未 得到描述。另外，通過(guò)逐步滲入兩個(gè)或S個(gè)Sm-id突變和另外的MD"res"(Aa,Aa)標(biāo) 記而生成的，具有四個(gè)、五個(gè)或甚至六個(gè)減毒突變的疫苗株同樣是新型的，對(duì)于鏈霉素：分 別為Smd1 -Sm-idI-Smda-Sm-idII-Sm-a-Sm-idIII(六個(gè)減毒突變） 和Sm-id1/Sm-idII/MD"res"(五個(gè)減毒突變)。
[0011] 發(fā)現(xiàn)具有兩個(gè)、四個(gè)或六個(gè)標(biāo)記的組合的Sm-id突變體的特定逆轉(zhuǎn)株譜(逐漸降 低的菌落大?。╅_(kāi)始；（a)對(duì)于Sm-id菌株，具有野生株的菌落大小，（b)對(duì)于Sm-id1/ Sm-idII菌株，具有Sm-idI樣菌落大小的菌落大小，和（C)對(duì)于Sm-id1/Sm-idII/ Sm-idIII構(gòu)建體，發(fā)現(xiàn)的最大菌落僅對(duì)應(yīng)于Sm-id1/Sm-idII樣克隆。因此，該些不是 野生株樣逆轉(zhuǎn)株。
[0012] 原則上，Smd突變體作為用于生成Sm-id克隆的起始菌株的選擇和分離屬于目 前領(lǐng)域發(fā)展水平。約10%的例如葡萄球菌屬（如7(9cc(9ci)、大腸桿菌（fecAericAia CO")、蠟狀芽抱桿菌（&?cj77化cere化0的正常Sm抗性突變體菌落是Smd克隆(作為外觀 生物學(xué)原則)。然而，該不應(yīng)用于沙口氏菌屬和彎曲桿菌屬。在顯示抗性的突變體菌落中沙 口氏菌屬的Smd克隆的出現(xiàn)頻率據(jù)報(bào)道為約0. 1%，或分別地，此類(lèi)菌株的分離可僅通過(guò)使 用誘變來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0013] 有趣的是，在分析約5000種Sm抗性突變體后，本發(fā)明人無(wú)法發(fā)現(xiàn)任何Smd菌株。 另外，必須強(qiáng)調(diào)Sm-id逆轉(zhuǎn)株的譜取決于Sm克隆而改變，相應(yīng)地，需要幾個(gè)Smd克隆作為起 始突變體。換言之，關(guān)于選擇的常見(jiàn)操作是不適用的。
[0014] 因?yàn)橥茰y(cè)核糖體Smd途徑是適應(yīng)的進(jìn)化原則，所W測(cè)試兩種可能機(jī)制： (a)Smd突變體在其形成后立即進(jìn)入死亡期。因此，此類(lèi)突變體只能從對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物中 分離，例如從《18小時(shí)/37°C培養(yǎng)物而不是> 48小時(shí)/37°C培養(yǎng)物中分離。
[0015] (b)在新生狀態(tài)期間，Smd克隆是脆弱的，顯示作為微型菌落(其可能被忽略）的延 遲生長(zhǎng)。該些微型菌落適合在傳代期間的"正常生長(zhǎng)"。
[0016] 對(duì)于彎曲桿菌屬，不存在關(guān)于Smd-和Sm-id突變體可用的數(shù)據(jù)。在文獻(xiàn)中，僅存 在關(guān)于Sm抗性突變體的一些提示；顯示高抗性的克隆只能通過(guò)使用針對(duì)濃度增加的鏈霉 素的多次傳代而獲得。一步Sm抗性只能通過(guò)使用20yg鏈霉素/ml的濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā) 明人使用100yg鏈霉素/ml用于分離顯示Sm抗性的突變體和Smd突變體的實(shí)驗(yàn)(通過(guò)72 小時(shí)/39°C培養(yǎng)物的鋪平板）失敗。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)盡管顯著增加的細(xì)菌量，但活菌數(shù) 從24小時(shí)/39°C到72小時(shí)/39°C培養(yǎng)物顯著減少，如下表中所示。
[0017] 表 1 結(jié)腸彎曲桿菌（Camp^obacter