一種耐熱保護(hù)劑、禽用耐熱保護(hù)劑活疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種耐熱保護(hù)劑、禽用耐熱保護(hù)劑活疫苗及其制備方法，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 冷凍干燥技術(shù)是生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要儲藏技術(shù)，廣泛地應(yīng)用于動(dòng)物用生物制品 的研發(fā)和生產(chǎn)中，以保持細(xì)菌、病毒和抗體等的生物活性，延長產(chǎn)品的有效期。凍干保護(hù)技 術(shù)是動(dòng)物用活疫苗生產(chǎn)中的關(guān)鍵技術(shù)，對于疫苗的保存、運(yùn)輸和使用具有很大的影響。
[0003] 影響凍干保護(hù)劑保護(hù)性能的因素主要來自兩方面:一是微生物因素，微生物的種 類差異(如是否為有囊膜病毒）、培養(yǎng)方式以及疫苗的種類等;二是保護(hù)劑的配方，選用保護(hù) 劑的原料性質(zhì)、配比和疫苗凍干曲線等。病毒對熱、酸敏感，在存放和運(yùn)輸過程中容易受到 環(huán)境中溫度和酸堿度的影響較大，因此需要選擇一種合適的凍干保護(hù)劑，能夠在不同保存 條件下有效的避免病毒遭受破壞，保持病毒活性，以延長病毒的存放時(shí)間。
[0004] 但是目前國內(nèi)禽用活疫苗產(chǎn)品仍然以常規(guī)疫苗(冷凍保存)為主，禽用耐熱保護(hù)劑 活疫苗(冷藏保存）市場占有率遠(yuǎn)低于1〇%，而且現(xiàn)有耐熱保護(hù)劑活疫苗還存在生產(chǎn)成本較 高、保護(hù)性能不盡理想等問題。因此，研發(fā)一種適于大規(guī)模生產(chǎn)、保護(hù)功能強(qiáng)的禽用活疫苗 耐熱凍干保護(hù)技術(shù)顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服已有技術(shù)之缺陷，提供一種耐熱保護(hù)劑、禽用 耐熱保護(hù)劑活疫苗及其制備方法，應(yīng)用耐熱保護(hù)劑的活疫苗具有耐熱性能好、保護(hù)功能強(qiáng) 的特點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明所述技術(shù)問題是以下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 一種耐熱保護(hù)劑，是由以質(zhì)量體積百分含量計(jì)的下列組分制成： 蔗糖10~15%，聚乙烯吡咯烷酮2~4%，蘆布若爾1~5%，PEG8000 0.1~2%，聚賴氨酸 1~4%，L-半胱氨酸1~4%，L-組氨酸1~2%，甘氨酸1~2%，余量為水。
[0007] 上述耐熱保護(hù)劑，所述耐熱保護(hù)劑包括保護(hù)劑A和保護(hù)劑B，所述保護(hù)劑A是將蔗 糖、聚乙烯吡咯烷酮和蘆布若爾溶解于水中，除菌后備用;所述保護(hù)劑B是將PEG8000、聚賴 氨酸、L-半胱氨酸、L-組氨酸和甘氨酸溶解于水中，除菌后備用。
[0008] -種禽用耐熱保護(hù)劑活疫苗的制備方法，使用如上述耐熱保護(hù)劑，并按以下步驟 制備： a. 病毒儲存液制備:將禽用活疫苗半成品病毒液與部分保護(hù)劑B按照體積比10: 2~ 10:5充分混勻，制成病毒儲存液，置-15°C以下保存； b. 疫苗制備:將病毒儲存液室溫放置，至完全融化，然后按半成品病毒液與耐熱保護(hù)劑 體積比1:1加入保護(hù)劑A和剩余的保護(hù)劑B，充分混勻后，定量分裝，冷凍干燥，制成禽用耐熱 保護(hù)劑活疫苗。
[0009] -種禽用耐熱保護(hù)劑活疫苗，它按照上述方法生產(chǎn)的禽用耐熱保護(hù)劑活疫苗。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明在半成品病毒液儲存時(shí)加入保護(hù)劑，有效延長半成品的保存期，保證半成品病 毒在常溫狀態(tài)下生物活性的維持，實(shí)現(xiàn)了常溫直接融化疫苗半成品，生產(chǎn)工序更簡化，且降 低了能耗。
[0011] 在耐熱保護(hù)劑中添加表面活性劑蘆布若爾、氨基酸聚合物聚賴氨酸，并與 PEG8000、聚乙烯吡咯烷酮等最適配比，降低了病毒在冷凍和真空干燥過程中的損傷，且提 高了產(chǎn)品在保存和使用中的穩(wěn)定性。
[0012] 本發(fā)明方法制備的禽用耐熱保護(hù)劑活疫苗可實(shí)現(xiàn)疫苗儲運(yùn)過程中的冷藏保存，延 長了保存期，由原來_15°C以下保存24個(gè)月提高到2~8°C保存36個(gè)月，37°C保存期15天，在 降低產(chǎn)品儲運(yùn)要求和成本的同時(shí)提高產(chǎn)品質(zhì)量及應(yīng)用的便捷性。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】做進(jìn)一步的說明。
[0014] 實(shí)施例1耐熱保護(hù)劑的制備 蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(K30)和PEG8000等耐熱保護(hù)劑組方原料均為常規(guī)試劑，市場上 有售。
[0015] ⑴配制耐熱保護(hù)劑1 配制1000 ml耐熱保護(hù)劑:稱取蔗糖100g、聚乙烯吡咯烷酮（K30)40g、蘆布若爾10g、 PEG8000 20g、聚賴氨酸40g、L-半胱氨酸10g、L-組氨酸20g和甘氨酸10g。配制時(shí)將蔗 糖、聚乙烯吡咯烷酮(K30)、蘆布若爾加入去離子水中并定容到500ml，充分溶解，配成保護(hù) 劑A，除菌后備用;將PEG8000、聚賴氨酸、L-半胱氨酸、L-組氨酸、甘氨酸加入去離子水中并 定容到500ml，充分溶解，配成保護(hù)劑B，除菌后備用。
[0016] (2)配制耐熱保護(hù)劑2 配制1000 ml耐熱保護(hù)劑:稱取蔗糖150g、聚乙烯吡咯烷酮(K30) 20g、蘆布若爾50g、 PEG8000 lg、聚賴氨酸10g、L-半胱氨酸40g、L-組氨酸20g和甘氨酸20g。配制時(shí)將蔗糖、 聚乙烯吡咯烷酮(K30)、蘆布若爾加入去離子水中并定容到500ml，充分溶解，配成保護(hù)劑A， 除菌后備用;將PEG8000、聚賴氨酸、L-半胱氨酸、L-組氨酸、甘氨酸加入去離子水中并定容 到500ml，充分溶解，配成保護(hù)劑B，除菌后備用。
[0017] 實(shí)施例2雞傳染性支氣管炎耐熱保護(hù)劑活疫苗的制備 由瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司提供雞傳染性支氣管炎(H120株)半成品病毒液(按照 《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000版)（以下簡稱"規(guī)程"）制備而成，毒種購自中國 獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）。
[0018] (1)雞傳染性支氣管炎病毒儲存液的制備 將兩份相同的雞傳染性支氣管炎半成品病毒液(每份1000ml)分別與耐熱保護(hù)劑1中的 保護(hù)劑B和耐熱保護(hù)劑2中的保護(hù)劑B按照體積比10 :4 (V: V )充分混勻（分別加入保護(hù)劑B 400ml)，制成病毒儲存液1和病毒儲存液2,置于-15°C保存，設(shè)立不添加保護(hù)劑的半成品病 毒液作為空白對照，并于保存〇、2、4和12個(gè)月時(shí)分別測定病毒含量。測定結(jié)果如表1所示 表1不同保存期病毒儲存液病毒含量檢測結(jié)果
添加耐熱保護(hù)劑1和耐熱保護(hù)劑2的兩組雞傳染性支氣管炎病毒儲存液在-15°c的條件 下保存12個(gè)月時(shí)病毒含量只下降了0.4 lg(EID5Q/0.1 ml);而對照組病毒含量下降迅速，其 在保存4個(gè)月時(shí)病毒含量已低于"規(guī)程"要求(制苗用的半成品病毒液病毒含量應(yīng)2 6.1 Ig (EID5Q/0. lml))，為不合格產(chǎn)品。因此，添加保護(hù)劑B能夠有效延長半成品病毒液的保存期 (至12個(gè)月），為生產(chǎn)高效價(jià)的雞傳染性支氣管炎活疫苗提供保障。
[0019] (2)疫苗制備 將兩種病毒儲存液室溫放置，至完全融化，然后按半成品病毒液與耐熱保護(hù)劑1:1的體 積比(V: V)，在病毒儲存液1中加入耐熱保護(hù)劑1的保護(hù)劑A(500ml)和保護(hù)劑B( 100mL)，在病 毒儲存液2中加入耐熱保護(hù)劑2的保護(hù)劑A(500ml)和B( 100ml)，充分混勻后，進(jìn)行定量分裝， 冷凍干燥，制成耐熱保護(hù)劑疫苗1和耐熱保護(hù)劑疫苗2。按照農(nóng)業(yè)部1049號公告(雞傳染性支 氣管炎耐熱保護(hù)劑活疫苗制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程、同類耐熱苗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn))方法制備同類耐熱 苗作為對照1;按"規(guī)程"方法制備的常規(guī)苗作為對照2。
[0020] (3)疫苗穩(wěn)定性測定 I檢測冷藏保存的穩(wěn)定性:于凍干前、凍干后2~8°C放置0、6、12、24和36個(gè)月時(shí)隨機(jī) 取樣測定病毒含量，3瓶/次。測定結(jié)果見表2 _檢測37t保存的穩(wěn)定性:每批取20瓶，于37t放置0、5、10和15天時(shí)隨機(jī)取樣測定病 毒含量，3瓶/次。測定結(jié)果見表3 表2不同保存期雞傳染性支氣管炎活疫苗病毒含量檢測結(jié)果(2~8°C) 單位：Ig (EID5。/羽）
表3不同保存期雞傳染性支氣管炎活疫苗病毒含量檢測結(jié)果(37°C) 單位：Ig (EID5。/羽）
由以上結(jié)果可以看出：采用本發(fā)明方法制備的兩組雞傳染性支氣管炎活疫苗，2~8°C 條件下保存36個(gè)月其病毒含量只下降0.6 Ig (EID5q/羽），病毒含量遠(yuǎn)高于"規(guī)程"要求(雞 傳染性支氣管炎活疫苗病毒含量應(yīng)23.5 Ig (EID5q/羽）），因此在冷藏條件下保存期可長 達(dá)36個(gè)月；對照1(同類耐熱苗）、對照2(常規(guī)苗)在2~8°C條件下保存，病毒含量下降較快， 對照1保存期為24個(gè)月、對照2保存期僅為6個(gè)月。本發(fā)明制備的疫苗在37°C條件下保存15天 其病毒含量下降0.6 Ig (EID5q/羽），病毒含量遠(yuǎn)高于"規(guī)程"規(guī)定，保存期可達(dá)15天;對照1 (同類耐熱苗）、對照2(常規(guī)苗)37°C條件下保存，病毒含量迅速下降，對照1保存期為10天、 對照2保存期不足5天。
[0021 ]實(shí)施例3按照實(shí)施例2方法制備雞新城疫耐熱保護(hù)劑活疫苗(La Sota株）。
[0022] 實(shí)施例4按照實(shí)施例2方法制備雞傳染性喉氣管炎耐熱保護(hù)劑活疫苗。
[0023] 實(shí)施例5按照實(shí)施例2方法制備雞傳染性法氏囊病耐熱保護(hù)劑活疫苗(B87株）。
[0024] 實(shí)施例6按照實(shí)施例2方法制備雞痘耐熱保護(hù)劑活疫苗。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種耐熱保護(hù)劑，其特征在于，是由以質(zhì)量體積百分含量計(jì)的下列組分制成：蔗糖 10~15%，聚乙烯吡咯烷酮2~4%，蘆布若爾1~5%，PEG8000 0.1~2%，聚賴氨酸1~4%，L-半胱氨酸1~4%，L-組氨酸1~2%，甘氨酸1~2%，余量為水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐熱保護(hù)劑，其特征在于，所述耐熱保護(hù)劑包括保護(hù)劑A和保 護(hù)劑B，所述保護(hù)劑A是將蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和蘆布若爾溶解于水中，除菌后備用;所述 保護(hù)劑B是將PEG8000、聚賴氨酸、L-半胱氨酸、L-組氨酸和甘氨酸溶解于水中，除菌后備用。3. -種禽用耐熱保護(hù)劑活疫苗的制備方法，其特征在于，使用如權(quán)利要求2所述的耐熱 保護(hù)劑，并按以下步驟制備： a. 病毒儲存液制備：將禽用活疫苗半成品病毒液與部分保護(hù)劑B按照體積比10 : 2~ 10:5充分混勻，制成病毒儲存液，置-15°C以下保存； b. 疫苗制備:將病毒儲存液室溫放置，至完全融化，然后按半成品病毒液與耐熱保護(hù)劑 體積比1:1加入保護(hù)劑A和剩余的保護(hù)劑B，充分混勻后，定量分裝，冷凍干燥，制成禽用耐熱 保護(hù)劑活疫苗。4. 一種禽用耐熱保護(hù)劑活疫苗，其特征在于，它按照權(quán)利要求3所述的方法生產(chǎn)的禽用 耐熱保護(hù)劑活疫苗。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種耐熱保護(hù)劑、禽用耐熱保護(hù)劑活疫苗及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的一種耐熱保護(hù)劑，組分包括蔗糖10～15%、聚乙烯吡咯烷酮2～4%、蘆布若爾1～5%、PEG8000？0.1～2%、聚賴氨酸1～4%、L-半胱氨酸1～4%、L-組氨酸1～2%、甘氨酸1～2%，余量為水；將半成品病毒液與耐熱保護(hù)劑混合，冷凍干燥，制成禽用耐熱保護(hù)劑活疫苗。本發(fā)明通過添加耐熱保護(hù)劑，降低了病毒在冷凍和真空干燥過程中損傷，提高了產(chǎn)品在保存和使用中的穩(wěn)定性；本發(fā)明方法制備的禽用耐熱保護(hù)劑活疫苗，實(shí)現(xiàn)了儲運(yùn)過程中冷藏保存，保存期延長到2～8℃保存36個(gè)月。
【IPC分類】A61K39/215, A61K39/12, A61P31/14, A61K39/275, A61P31/20, A61K39/17, A61K47/32
【公開號】CN105535981
【申請?zhí)枴緾N201511000681
【發(fā)明人】何平有, 鄒立宏, 劉濤, 柳珊, 郁宏偉, 朱秀同, 梁武, 楊保收, 邱貞娜
【申請人】瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月29日