一種純化蛋白質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明一般涉及一種純化蛋白質(zhì)的方法。更特別地，本發(fā)明涉及一種從同一起始原料純化觸珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白的方法，及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]溶血的特征在于紅細胞破壞，并且是與紅細胞異常相關(guān)的貧血病癥的性質(zhì)標志(hall-mark)，比如酶缺陷、血紅蛋白病、遺傳性球形紅細胞增多癥、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿癥和棘突紅細胞(spur cell)貧血，以及外源因素比如脾腫大、自身免疫性病癥(例如，新生兒溶血病)、遺傳性疾病(例如，鐮狀細胞病或G6H)缺失癥)、微血管病性溶血、革蘭氏陽性細菌感染(例如，鏈球菌、腸道球菌和葡萄球菌)、寄生蟲感染(例如，瘧原蟲)、毒素和創(chuàng)傷(例如燒傷)。溶血也是一種常見的輸血病癥，特別是大量輸血和在使用體外心肺維持的患者中。
[0003]患有與溶血相關(guān)病癥的患者中可見的副作用主要歸因于從紅細胞釋放鐵和含鐵化合物，比如血紅蛋白(Hb)和血紅素。在生理條件下，釋放的血紅蛋白被可溶性蛋白質(zhì)比如觸珠蛋白結(jié)合，并轉(zhuǎn)運到巨噬細胞和肝細胞。然而，當溶血發(fā)生率加快且事實上變成病理性時，觸珠蛋白的緩沖能力被壓倒。因此，血紅蛋白被快速氧化成鐵血紅蛋白，其依次釋放游離血紅素(包含原卟啉IX和鐵)。雖然血紅素在一些生物進程中起決定作用(例如，作為必需蛋白質(zhì)比如血紅蛋白和肌紅蛋白的一部分)，但是游離血紅素是高毒性的。游離血紅素是氧化還原活性鐵的來源，其產(chǎn)生損害類脂膜、蛋白質(zhì)和核苷酸的高毒性活性氧種類(ROS)。血紅素的毒性由于其插入類脂膜的能力而進一步加劇，在類脂膜中血紅素引起膜組分氧化且促進細胞溶解和死亡。
[0004]在生理學穩(wěn)態(tài)條件下和在輕度溶血期間，連續(xù)低水平細胞外Hb/血紅素暴露的進化壓力導(dǎo)致控制游離Hb/血紅素副作用的補償機制。這些系統(tǒng)包括釋放一組結(jié)合Hb或血紅素的血漿蛋白，包括Hb清除劑觸珠蛋白(Hp)和血紅素清除劑蛋白質(zhì)血紅素結(jié)合蛋白(Hx)和α -1微小球蛋白。然而，雖然在生理學穩(wěn)態(tài)條件下，內(nèi)源性Hp和Hx控制游離Hb/血紅素的副作用，但是它們在病理生理學條件(比如與溶血相關(guān)的那些條件)下保持穩(wěn)態(tài)Hb/血紅素水平的功效很小。
[0005]本發(fā)明提供一種從同一起始原料純化Hp和Hx的方法。所述純化的蛋白質(zhì)可用于治療與溶血和Hb/血紅素水平異常相關(guān)的病癥的組合物中。
[0006]發(fā)明簡述
[0007]在本發(fā)明的一個方面，提供一種從含有觸珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白兩種蛋白質(zhì)的溶液中純化這兩種蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括:
[0008](i)提供含有觸珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白兩者的溶液；
[0009](ii)通過向溶液中加入硫酸銨從所述溶液中沉淀觸珠蛋白；
[0010](iii)從含有血紅素結(jié)合蛋白的溶液中分離沉淀的觸珠蛋白；和
[0011](iv)以一個或多個步驟分別純化觸珠蛋白和/或血紅素結(jié)合蛋白。
[0012]在本發(fā)明的另一個方面，提供一種包含通過本文公開的方法回收的觸珠蛋白的組合物。
[0013]在本發(fā)明的另一個方面，提供一種包含通過本文公開的方法回收的血紅素結(jié)合蛋白的組合物。
[0014]在本發(fā)明的另一個方面，提供一種包含通過本文公開的方法回收的轉(zhuǎn)鐵蛋白的組合物。
[0015]在本發(fā)明的另一個方面，提供一種包含通過本文公開的方法回收的觸珠蛋白和通過本文公開的方法回收的血紅素結(jié)合蛋白的組合物。
[0016]在本發(fā)明的另一個方面，提供一種包含含量為總蛋白的至少95%的觸珠蛋白的組合物。在本發(fā)明的另一個方面，提供一種包含含量為總蛋白的至少80%的血紅素結(jié)合蛋白的組合物。在本發(fā)明的另一個方面，提供一種包含含量為總蛋白的至少80%的組合的血紅素結(jié)合蛋白和觸珠蛋白的組合物。
[0017]在本發(fā)明的另一個方面，提供一種包含如本文公開的本發(fā)明的組合物和可藥用載體的制劑。
[0018]在本發(fā)明的另一個方面，提供一種治療與溶血相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括向需要其的受試者施用如本文公開的本發(fā)明的組合物或制劑。
[0019]在本發(fā)明的另一個方面，提供如本文公開的本發(fā)明的組合物或制劑在制備用于治療與溶血相關(guān)的病癥的藥物中的用途。
[0020]附圖簡述
[0021]圖1為Cohn分級過程的流程圖。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當認識到改變圖1中描述的過程參數(shù)(例如，pH、乙醇濃度、溫度等)也可以應(yīng)用于產(chǎn)生Cohn級分。
[0022]圖2顯示在2.0M,2.5M、3.0M,3.5M和4.0M硫酸銨的存在下沉淀之后，剩余濾液中轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、白蛋白(Alb)、血紅素結(jié)合蛋白(HPX)和觸珠蛋白(HAP)的回收。
[0023]圖3顯示實驗設(shè)計(DOE)的需要性圖，顯示從血漿級分中沉淀觸珠蛋白而使血紅素結(jié)合蛋白保留在溶液中所期望的條件。DOE是一組用于評價pH和硫酸銨濃度對從觸珠蛋白分離血紅素結(jié)合蛋白的能力的影響的控制實驗。使用因子數(shù)學設(shè)計來設(shè)計和分析數(shù)據(jù)。圖3中描繪的需要性圖使用該數(shù)學設(shè)計來決定應(yīng)當產(chǎn)生血紅素結(jié)合蛋白和觸珠蛋白兩者的最佳分離和回收的最期望條件。
[0024]圖4顯示在本文公開的純化方法的各種步驟之后回收的血紅素結(jié)合蛋白的SDS-PAGE電泳。使用預(yù)制的10% Tris-甘氨酸凝膠(Novex, EC6075)進行SDS-PAGE分析。將所有樣品都在Tri S-甘氨酸SDS樣品緩沖液(LC2676)中稀釋成0.lmg/mL的濃度，并且將20 μ L的每種樣品裝入凝膠的樣品孔中。運行時間和電壓設(shè)置為凝膠制造商的建議值(恒定125V)。用易于使用類型的考馬斯亮藍染色溶液(Novex，Simply BlueSafestain, LC6065)對每個凝膠染色。泳道I (LMWS)含有Novex靈敏未染色標準品(NovexSharp Unstained Protein Standards)，LC580I。
[0025]圖5顯示在本文公開的純化方法的各種步驟之后回收的觸珠蛋白中間體的SDS-PAGE電泳(使用圖4中上述的方法)。泳道2中的觸珠蛋白標準品來自Benesis(T043HPX)。
[0026]圖6顯示Capto Q洗脫液在10 % Tris-甘氨酸未還原SDS-PAGE電泳凝膠(使用圖4中描述的方法)上的蛋白質(zhì)印跡。然后，將單獨的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜，并阻斷該膜防止任何非特異性抗體結(jié)合。然后，用含有人觸珠蛋白抗體(兔子抗-人觸珠蛋白Sigma H8636)的溶液培養(yǎng)硝基纖維素膜。然后，用硝基纖維素膜(山羊抗-兔子HRP，SigmaA6154)培養(yǎng)與辣根過氧化酶(HRP)連接的二級抗體。接著，用含有過氧化物的溶液展開硝基纖維素，由此僅顯影特別地含有人觸珠蛋白的蛋白質(zhì)帶。泳道含有不同濃度的CaptoQ ImpRes Eluate (T0209001)(泳道 2-1:10 稀釋，0.lmg/mL，20 μ L 負載；泳道 3-1:20 ;泳道4-1:40 ;泳道 5-1:80 ;泳道 6-1:160 ;泳道 7-1:320 ;泳道 8-1:640 ;泳道 9-1:1280 ;和泳道10-1:2560)。蛋白質(zhì)印跡表明Capto Q Eluate中存在大部分條帶是觸珠蛋白。
[0027]圖7顯示在本文公開的純化方法的各種步驟之后從離子交換層析(Capto DEAE)回收的轉(zhuǎn)鐵蛋白的SDS-PAGE電泳(使用圖4中描述的方法)。峰I (泳道4)載荷重，但是似乎是純轉(zhuǎn)鐵蛋白(與泳道2，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，Sigma Τ8158比較)。這表明從辛基瓊脂糖沖洗物(Octyl Sepharose Wash)級分純化轉(zhuǎn)鐵蛋白是可能的，其也意味著從同一起始原料純化血紅素結(jié)合蛋白、觸珠蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白是可能的。
[0028]圖8顯示在本文公開的純化方法期間來自離子交換色譜柱的轉(zhuǎn)鐵蛋白線性梯度的色譜圖。在圖7中，通過SDS-PAGE分析標記I至4的峰。
[0029]圖9為根據(jù)本文公開的一個實施方案的血紅素結(jié)合蛋白純化方法的流程圖。
[0030]圖10為根據(jù)本文公開的一個實施方案的觸珠蛋白純化方法的流程圖。
[0031]圖11為根據(jù)本文公開的一個實施方案的組合觸珠蛋白/血紅素結(jié)合蛋白/轉(zhuǎn)鐵蛋白純化方法的流程圖。
[0032]詳細說明
[0033]在整個說明書中，除非上下文另外要求，否則措辭〃包括〃或其變化比如〃包括〃或"包含"應(yīng)當理解為意味著包含所述要素或整數(shù)或要素組或整數(shù)組，但不排除任何其它要素或整數(shù)或要素組或整數(shù)組。
[0034]在本說明書中參考的任何現(xiàn)有出版物(或來源于其的信息)或其中任何物質(zhì)都是已知的，不會且不應(yīng)當被視為承認或認可或以任何形式暗示該現(xiàn)有出版物(或來源于其的信息)或已知物質(zhì)構(gòu)成本說明書相關(guān)的努力領(lǐng)域的普通常識部分。
[0035]必須指出，除非上下文另有清楚的規(guī)定，否則如本說明書中使用的單數(shù)形式“一個”、“一種”或“所述”包括復(fù)數(shù)方面。因此，例如提及“一種樹脂”包括單個樹脂，以及兩種或多種樹脂；提及“組合物”包括單一組合物，以及兩種或多種組合物；諸如此類。
[0036]在不存在任何相反指示下，在整個說明書中提及“ ％ ”含量應(yīng)當視為平均％ w/w (重量/重量)。例如，包含含量為總蛋白的至少95%的觸珠蛋白的溶液意味著指包含含量為總蛋白的至少95% w/w的觸珠蛋白的組合物。
[0037]本發(fā)明至少部分地基于發(fā)現(xiàn)了可以從同一起始原料純化觸珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白。因此，在本發(fā)明的一個方面，提供一種從含有觸珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白兩種蛋白質(zhì)的溶液中純化這兩種蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括:
[0038](i)提供含有觸珠蛋白和血紅素結(jié)合蛋白兩者的溶液；
[0039](ii)通過向該溶液中加入硫酸錢從所述溶液中沉淀觸珠蛋白；
[0040](iii)從含有血紅素結(jié)合蛋白的該溶液中分離沉淀的觸珠蛋白；和
[0041](iv)以一個或多個步驟分別純化觸珠蛋白和/或血紅素結(jié)合蛋白。
[0042]觸珠蛋白(Hp)是一種由成人的肝合成且分泌到血漿中四鏈(α2β)糖蛋白。Hp的前肽形式被蛋白酶切割成α-鏈和β-鏈。然后，Hp蛋白的兩個α-亞基和兩個β-亞基通過鏈間二硫鍵結(jié)合，形成成熟肽，其可以是(α β)_ 二聚體或(α β)_多聚體。血紅素結(jié)合蛋白(Hx)是一個包含單一 439個氨基酸長肽鏈的60-kD血漿β-1B-糖蛋白，其形成由結(jié)構(gòu)域間連接基結(jié)合的兩個結(jié)構(gòu)域。其對于任何表征的血紅素-結(jié)合蛋白的血紅素都具有已知最高的親和力(KcKlpM)，并且以結(jié)構(gòu)域間連接基形成的口袋內(nèi)Hx的兩個結(jié)構(gòu)域之間的等摩爾比結(jié)合血紅素。
[0043]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)濃度在約2.0M至約2.5Μ范圍內(nèi)，優(yōu)選地在約2.2Μ至約2.5Μ范圍內(nèi)，更優(yōu)選約2.4Μ的硫酸銨對于從同一起始原料分離兩種蛋白質(zhì)是最佳的。因此，在一個實施方案中，所述方法包括通過向溶液中加入約2.0M至約2.5Μ的硫酸銨從所述溶液中沉淀觸珠蛋白。在另一個實施方案中，所述方法包括通過向溶液中加入約2.2Μ至約2.5Μ的硫酸銨從所述溶液中沉淀觸珠蛋白。在又另一個實施方案中，所述方法包括通過向溶液中加入約2.4Μ的硫酸銨從所述溶液中沉淀觸珠蛋白。在特定實施方案中，硫酸銨的濃度為2.0M或 2.1M 或 2.2Μ 或 2.3Μ 或 2.4Μ 或 2.5Μ。
[0044]本發(fā)明人還表明對于從同一起始原料分離兩種蛋白質(zhì)而言，維持在小于或等于約8的范圍、優(yōu)選約6到約8、更優(yōu)選約7的pH是最佳的。因此，在一個實施方案中，所述方法包括在小于或等于8的pH從溶液中沉淀觸珠蛋白。在另一個實施方案中，所述方法包括在約6至約8范圍內(nèi)的pH從溶液中沉淀觸珠蛋白。在另一個實施方