一種制備GGTA1和iGb3S雙基因敲除的非人哺乳動物的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及制作基因敲除動物模型的領(lǐng)域，具體講，涉及一種制備GGTAl和iGb3S 雙基因敲除的非人哺乳動物的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由哺乳動物細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的生物源性材料因其具有良好的生物相容性被廣泛 用于外科的創(chuàng)傷修復(fù)、組織重建和組織工程的支架材料等。異種器官也早已成為解決器官 移植中供器官嚴(yán)重缺乏的潛在途徑之一。然而，動物源性生物材料或異種器官組織應(yīng)用于 人體所帶來的免疫學(xué)問題直接影響著這類材料使用的安全性和有效性。異種器官移植的最 大障礙是供器官異種抗原與受者體內(nèi)天然抗體結(jié)合后激活補(bǔ)體系統(tǒng)，攻擊供器官而產(chǎn)生的 超急性免疫排斥反應(yīng)（Hyperacute rejection，HAR)，其發(fā)生時間在異種移植后的幾分鐘至 數(shù)小時，供器官在短時間內(nèi)發(fā)生功能衰竭使移植失敗。動物源性生物材料雖經(jīng)各種去除抗 原的處理，卻難以徹底去除所有的異種抗原，殘留抗原仍然是造成慢性免疫排斥反應(yīng)和免 疫毒性而影響創(chuàng)傷愈合的重要因素。
[0003] 已有研宄顯示異種抗原α -半乳糖基抗原（a-1，3-galactosyle，a-Gal)是動 物源性生物材料或異種器官移植超急性免疫排斥反應(yīng)中的主要靶抗原。a -Gal是含有聚 乳糖胺核心末端殘基的細(xì)胞表面分泌型糖蛋白或糖脂，廣泛存在于豬和其它低等動物體 內(nèi)。a -Gal 主要受 α -1，3 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（a 1，3-galactosyltransferase, a -1，3GT，或 GGTA1)及異紅細(xì)胞糖苷醋合成酶（isoglobotriosylceramide synthase 或 isogloboside 3synthaSe，iGb3S)調(diào)控。由于人體及類人猿、舊世紀(jì)猴的半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因有2個堿基 錯位變異而不表達(dá)Gal抗原，但人血清中存在高滴度的抗a -Gal抗體（占總血清球蛋白的 1-3% )，因此當(dāng)人體接受含有Gal抗原的生物材料或異種器官移植時會導(dǎo)致超急性免疫排 斥反應(yīng)及慢性的免疫毒性反應(yīng)。有研宄證實(shí)人血清中的抗a-Gal抗體既與GGTAl催化的 Gal抗原（糖蛋白）反應(yīng)，也與iGb3S催化的Gal抗原（糖脂肪）反應(yīng)。
[0004] 國際上早在90年代就有通過構(gòu)建GGTAl基因敲除小鼠，來研宄a -Gal相關(guān)的免 疫學(xué)反應(yīng)，探討不含Gal抗原的克隆動物的構(gòu)建方法和可行性。早在1996年，RG Tearle等 報(bào)告了 GGTAl基因敲除小鼠模型的成功制作方法，之后開始有報(bào)告使用GGTAl基因敲除小 鼠模型研宄其與人所誘導(dǎo)抗體的相似性及其免疫學(xué)特征。Chiang TR等報(bào)告，GGTAl基因敲 出小鼠免疫后誘導(dǎo)的抗-Gal抗體與a -Gal結(jié)合的親和性和人的抗Gal抗體相似，是能夠 誘導(dǎo)Gal抗原陽性異種心臟補(bǔ)片的超急性免疫排斥反應(yīng)。Chong A等報(bào)告，GGTAl基因敲除 小鼠能夠誘導(dǎo)自然的抗a-Gal IgM和IgG，并呈現(xiàn)周齡依存性增強(qiáng)；在同種異體或異種補(bǔ) 片移植后可以觀察到T-cell依存性的抗a -Gal抗體反應(yīng)。這些研宄提示GGTAl基因敲除 小鼠模型對Gal抗原殘留誘導(dǎo)的免疫毒性具有敏感的反應(yīng)性。
[0005] a -Gal抗原引起的超急性免疫排斥反應(yīng)和慢性免疫毒性的克服方法得到了深入 研宄。許多實(shí)驗(yàn)室采用了不同的方法對供器官或細(xì)胞進(jìn)行處理，其中以酶處理法、物理化 學(xué)分離法及交聯(lián)法和基因改造等方法的研宄最廣泛。在2000年初研宄者們開始了 GGTAl 基因敲除豬的研宄，甚至GGTAl基因敲除牛的研宄，期望能夠直接從GGTAl基因敲除豬或牛 獲得沒有Gal抗原的組織或器官，以避免動物源性生物材料及異種臟器移植的免疫排斥反 應(yīng)。Dai Y及Lai L等報(bào)道，他們運(yùn)用核轉(zhuǎn)移技術(shù)成功培育出了 GGTAl基因敲除豬（GT/KO pig)。實(shí)驗(yàn)研宄顯示GGTAl基因敲除豬來源的生物材料能夠顯著減輕Gal抗原誘導(dǎo)的超急 性排斥反應(yīng)。
[0006] 國內(nèi)關(guān)于GGTAl基因敲除動物模型的研宄也取得了一定的成果，戴一凡和賴良學(xué) 教授是國際上最早報(bào)道GGTAl基因敲除雜合子豬的學(xué)者。他們回國后在國內(nèi)先后成功構(gòu)建 了 GGTAl基因敲除豬的模型，并已經(jīng)獲得了純合子。然而，關(guān)于iGb3S基因敲除動物的研宄 國內(nèi)未見報(bào)道。
[0007] 有研宄發(fā)現(xiàn)，GGTAl基因敲除的小鼠或者豬仍然表達(dá)a -Gal抗原，仍然能夠觀察 到后期的免疫排斥反應(yīng)。另外有研宄已經(jīng)證實(shí)人的組織器官中不表達(dá)活性的iGb3,提示 由iGb3S轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)寫的iGb3含半乳糖基脂蛋白可能是動物組織、器官或動物源性材 料移植于人體時造成異種免疫排斥反應(yīng)的另一種外源性抗原。Milland等的研宄顯示在 GGTAl基因敲除動物體內(nèi)仍然表達(dá)低水平但有顯著意義的Gal抗原。GGTAl基因敲除小鼠 表達(dá)iGb3S mRNA，更重要的是GGTAl基因敲除小鼠來源的抗體與iGb3S合成的脂肪骨架的 Gal α (1，3) Gal抗原反應(yīng)。這一研宄結(jié)果提示iGb3S合成的Gal α (1，3) Gal糖脂肪抗原可 能是造成異體移植慢性免疫排斥反應(yīng)的主要原因。因此，Milland等認(rèn)為GGTAl基因敲除 動物雖然避免了急性免疫排斥反應(yīng)，脂肪連接的Gal抗原是異體移植后期慢性免疫排斥反 應(yīng)的根源。有學(xué)者開始研宄iGb3介導(dǎo)的免疫反應(yīng)以及iGb3S缺損模型動物的免疫學(xué)變化。
[0008] 因此，GGTAl和iGb3S雙基因敲除小鼠模型將是深入研宄和評價Gal抗原介導(dǎo)的 免疫反應(yīng)的有利工具。然而，GGTAl和iGb3S雙基因敲除小鼠國內(nèi)、國際都還沒有報(bào)道。針 對現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺陷，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提出了一種制備GGTAl和iGb3S雙基因敲除的非人哺 乳動物的方法。
[0010] 本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出該GGTAl和iGb3S雙基因敲除的非人哺乳動物的 應(yīng)用。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案為：
[0012] 一種制備GGTAl和iGb3S雙基因敲除的非人哺乳動物的方法，包括以下步驟：
[0013] (1)構(gòu)建打靶載體：分別從基因組DNA中分離GGTAl和iGb3S基因，經(jīng)長鏈PCR方 法擴(kuò)增獲得同源臂，與抗生素耐藥基因復(fù)合構(gòu)建GGTAl打靶載體和iGb3S打靶載體；
[0014] (2)將GGTAl打靶載體轉(zhuǎn)入到胚胎細(xì)胞，將重組胚胎細(xì)胞注入代孕動物胚胎中， 移植到假孕動物體內(nèi)，與正常動物交配；對得到的嵌合體動物進(jìn)行基因型驗(yàn)證，篩選基因成 功敲除的陽性基因敲除的嵌合體動物；進(jìn)一步與野生型動物交配，獲得GGTAl的Fl代雜合 子；
[0015] (3)將iGB3S打靶載體轉(zhuǎn)入到胚胎細(xì)胞，將重組胚胎細(xì)胞注入代孕動物胚胎中， 移植到假孕動物體內(nèi)，與正常動物交配；對得到的嵌合體動物進(jìn)行基因型驗(yàn)證，篩選基因成 功敲除的陽性基因敲除的嵌合體動物；進(jìn)一步與野生型動物交配，獲得iGB3S的Fl代雜合 子；
[0016] (4)將GGTAl的Fl代雜合子和iGB3S的Fl代雜合子之間交配后獲得兩條染色體 均被剔出的GGTAl和iGb3S純合子動物；
[0017] (5)再將GGTAl和iGB3S純合子動物進(jìn)行交配，篩選GGTAl和iGb3S同時缺失的雙 基因敲除純合子動物，并建系獲得基因敲除動物種群。
[0018] 本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為：非人哺乳動物為小鼠，進(jìn)一步優(yōu)選C57BL小鼠。
[0019] 本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為：GGTAl基因敲除為敲除GGTAl基因的功能性催化 區(qū)第九外顯子，其核苷酸序列如SEQ NO ID: 1所示；iGb3S基因敲除為敲除iGb3S基因的功 能性催化區(qū)第五外顯子，其核苷酸序列如SEQ NO ID:2所示。
[0020] 本發(fā)明的第三優(yōu)選技術(shù)方案為：所述GGTAl打靶載體含有5'同源臂、耐藥抗生素 基因 NeoR-PA和3'同源臂，用NeoR-PA分別取代第9外顯子；所述iGb3S打靶載體含有5' 同源臂、耐藥抗生素基因 NeoR-PA和3'同源臂，用NeoR-PA分別取代第5外顯子。
[0021] 本發(fā)明的第四優(yōu)選技術(shù)方案為：用于GGTAl打靶載體構(gòu)建的耐藥抗生素基因 NeoR-PA 5'端和3'端的同源臂序列取自小鼠第二條染色體上GGTAl基因第9外顯子的 5'端和3'端，分別為4. 123kb和7. 343kb ;用于iGb3S打靶載體構(gòu)建的耐藥抗生素基因 NeoR-PA 5'端和3'端的同源臂序列取自小鼠第四條染色體上iGb3S基因第5外顯子的5' 端和3端，分別為8. 3kb和9. Ikb。
[0022] 本發(fā)明的第五優(yōu)選技術(shù)方案為：
[0023] GGTAl打靶載體的構(gòu)建步驟為：
[0024] (1)從正常C57BL/6J小鼠分離基因組DNA，擴(kuò)增第9外顯子5'端Cl片段、A片段 和3'端B片段、C2片段，分別連接到pBlunt載體；
[0025] (2)將酶切鑒定、測序正確的A和B片段依次連接到pL452載體得到 PL452-GGTA1-A-B，同時，通過Overlap PCR將測序正確的Cl、C2片段融合后連接到 pDTA-Down 載體上；
[0026] (3)將連接正確的 pL452-GGTAl-A-B 用 EcoRV 酶切，pL452-AB 切出 2885bp、2930bp 兩條帶，回收目的片段A-NeoR-B，電轉(zhuǎn)含pBCTG的BAC菌進(jìn)行重組；菌落PCR檢測A-NeoR-B 片段重組BAC，鑒定擴(kuò)增條帶正確；
[0027] (4)pDTA-down-GGTAl-C 的線性化處理，g卩 EcoRV 酶切處理 pDTA-Down-GGTAl-C， 回收目的條帶，電轉(zhuǎn)已經(jīng)重組了 NeoR的GGTAl的BAC菌；pDTA-GGTAl-C拯救GGTAl-NeoR BAC (AmpR+KanR);對C拯救后的菌落進(jìn)行PCR檢測鑒定，將重組正確克隆進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng) Stbl3純化后酶切驗(yàn)證；
[0028] iGb3S打靶載體的構(gòu)建步驟為：
[0029] (1)從正常C57BL/6J小鼠分離基因組DNA，擴(kuò)增第5外顯子5'端Cl片段、A片段 和3'端B片段、C2片段，分別連接到pBlunt載體；
[0030] (2)將酶切鑒定、測序正確的A和B片段依次連接到PL452載體得到 pL452-iGb3S-A-B，同時，通過Overlap PCR將測序正確的Cl、C2片段融合后連接到 pDTA-Down 載體上；
[0031] (3)將連接正確的 pL452-iGb3S-A-B 用 EcoRV 酶切，pL452-AB 切出 2880bp、2885bp 兩條帶，回收目的片段A-NeoR-B，電轉(zhuǎn)含pBCTG的BAC菌進(jìn)行重組；菌落PCR檢測A-NeoR-B 片段重組BAC，鑒定擴(kuò)增條帶正確；
[0032] (4)pDTA-down-iGb3S-C 的線性化處理，即 EcoRV 酶切處理 pDTA-Down-iGb3S-C， 回收目的條帶，電轉(zhuǎn)已經(jīng)重組了 NeoR的iGb3S的BAC菌；pDTA-iGb3S-C拯救iGb3S-NeoR BAC (AmpR+KanR);對C拯救后的菌落進(jìn)行PCR檢測鑒定，將重組正確克隆進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng) Stbl3純化后酶切驗(yàn)證。
[0033] 本發(fā)明的第六優(yōu)選技術(shù)方案為：步驟（2)包括以下步驟：制備不育雄鼠和假孕母 鼠；超排卵；收獲受精卵；目的DNA的制備；將目的DNA導(dǎo)入受精卵；受精卵的移植；首建鼠 中目的DNA整合情況的檢測；通過雜交繁育基因剔出小鼠種系。
[0034] 本發(fā)明還涉及來自雙基因敲除動物的精子、卵細(xì)胞、受精卵、胚胎、子代、組織或細(xì) 胞。
[0035] 本發(fā)明還涉及雙基因敲除的非人哺乳動物或來自基因敲出動物的精子、卵細(xì)胞、 受精卵、胚胎、子代、組織或細(xì)胞在生物源性材料、異種器官移植領(lǐng)域研宄和評價及Gal抗 原介導(dǎo)的腫瘤免疫研宄與評價中的應(yīng)用；所述生物源性材料包括動物源性或取自人體的， 所述的動物源性生物材料不包括靈長類動物；所述的動物源性生物材料的種類包括取自動 物體內(nèi)的各種組織、臟器及其衍生物，或者由組織或臟器制備的各種材料；所述的靈長類動 物特指古世紀(jì)猴、狒狒。所述的應(yīng)用包括在免疫學(xué)研宄、免疫毒理學(xué)、異種免疫排斥反應(yīng)及 其機(jī)理的研宄、腫瘤免疫學(xué)研宄及安全性評價中的應(yīng)用；所述的安全性評價包括生物源性 材料、GGTAl基因敲除豬、牛等異種器官移植在臨床試驗(yàn)前的安全性評價。
[0036] 打靶載體剔出序列片段是GGTAl第9外顯子的全長694bp，其核苷酸序列如SEQ NO ID:1 ：
[0037] 20430G TACATTGAGC ATTACTTAGA AGACTTTCTG
[0038] 20461GAGTCTGCTG ACATGTACTT CATGGTTGGC CATCGGGTCA TATTTTACGT CATGATAGAC
[0039] 20521GACACCTCCC GGATGCCTGT CGTGCACCTG AACCCTCTAC ATTCCTTACA AGTCTTTGAG
[0040] 20581ATCAGGTCTG AGAAGAGGTG GCAGGATATC AGCATGATGC GCATGAAGAC CATTGGGGAG