一種建立cyp2c11基因敲除大鼠模型的方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種建立CYP2C11基因敲除大鼠模型的方法，屬于轉基因技術領域。
【背景技術】
[0002] 細胞色素 P450 (cytochrome P450 )，又稱混合功能氧化酶（mixed-function oxidase)或單加氧酶(monooxygenase)，主要存在于肝微粒體中，在內源性物質和包括藥 物、環(huán)境化合物在內的外源性物質的生物轉化中起著關鍵的作用。P450是藥物代謝的第I相 酶，它的活性對藥物的代謝和毒性產(chǎn)物的生成往往起著決定性作用。人體內約有75%的藥 物通過 CYP 代謝。人體內 CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1 和 CYP3A4 與 95% 現(xiàn)有臨床 藥物的代謝相關，而與大鼠相對應的CYP1A2，CYP2C11，CYP2C13，CYP2D2，CYP2E1和CYP3A1同 工酶是當兩種或兩種以上藥物聯(lián)合應用時，由于藥物之間的相互作用而使藥效或不良反應 加強或減輕，甚至出現(xiàn)未預期的不良反應。因此，對該酶系的研究一直是藥物代謝和毒理學 中的熱點領域。
[0003] 盡管P450基因敲除小鼠模型的建立和應用已經(jīng)取得了初步成功，但在實際的操作 過程中一直存在兩個主要困難，一是在臨床前藥物安全性評價工作中，常規(guī)的手段包括基 于大鼠肝微粒體的體外試驗、基于大鼠的各類毒性試驗和藥代動力學試驗，如何把這些大 鼠的數(shù)據(jù)與基因敲除小鼠模型的實驗數(shù)據(jù)加以整合，需要操作者對不同物種的P450酶系具 有深入的理論認識和長期的實踐經(jīng)驗，這一困難在相當程度上制約了 P450基因敲除小鼠模 型的使用和推廣；二是小鼠模型受限于其物種，存在可檢測組織體積小，體液容量小等特 點，這對后續(xù)的藥代動力學和毒理學試驗提出了更高的技術要求。因此建立P450基因敲除 大鼠模型，將切實解決上述兩個困難。
[0004] 人類CYP2C9基因位于10號染色體，全長55kb，包含9個外顯子和8個內含子。目前已 證實約 10%-20%的臨床常用處方藥物是CYP2C9的底物，其中包括抗癲癇作用的苯妥英鈉、 抗凝血作用的華法林等一些治療指數(shù)較窄的藥物。C Y P 2 C11作為大鼠 P 4 5 0基因，與人類 CYP2C9具有基本相同的底物和組織分布(尤其在雄性大鼠體內），被視為CYP2C9的直系同源 基因。因此，CYP2C11基因敲除大鼠模型缺乏人類CYP2C9相類似的代謝能力，可以較好的模 擬CYP2C9慢代謝人群，驗證候選藥物針對該人群的安全性。因此CYP2C11實驗模型可以用以 評估人體內基于CYP2C9藥物相互作用情況，另外也可以作為個體化給藥、致癌物代謝等研 究的動物模型。
[0005] 鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN)和類轉錄激活因子效應物核酸酶 (Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)分別通過鋅指蛋白 (Zinc finger protein，ZNP)和類轉錄激活因子效應物（Transcription activator-like effector)識別DNA序列，并在特定位點對DNA進行切割，形成雙鏈斷裂 (Double strand breaks DSB)，隨后在非同源末端連接（Non homologous end joining， NHEJ)修復機制下形成隨機的多個堿基的插入或刪除，從而實現(xiàn)基因敲除;或者在同源重組 (Homologous recombination，HR)修復機制以及修復模板(donor)存在的條件下，實現(xiàn)定點 的單個堿基或者長片段的插入、刪除或者突變。此外，利用TALEN和特定的轉錄因子或者抑 制因子結合，還可以實現(xiàn)對內源基因特異性的轉錄激活或者抑制、操縱內源基因的表達。目 前TALEN技術的靶位點已經(jīng)覆蓋了多個物種的全基因組，實現(xiàn)了真正意義上的全基因組操 作。ZFN和TALEN技術不僅極大地提高了基因打靶的效率，而且更高效地實現(xiàn)了對基因組的 定點操作以及基因表達控制，如定點插入、刪除和替換、轉錄抑制或激活等，真正的在應用 水平實現(xiàn)了對動植物基因組的精細操作，因此也將以ZFN和TALEN為代表的技術統(tǒng)稱為基因 組編輯(Genome editing)技術。
[0006] CRISPR是指成族的、規(guī)律的短回文重復序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) <XRISPR-CAS9系統(tǒng)主要是由三個部分組成，分別是Cas9蛋 白、precursor CRISPR RNA (pre-crRNA)和 trans-activating crRNA (tracrRNA)， CRISPR-CAS9識別特定的DNA序列，進行特定位點切割造成雙鏈DNA斷裂(Double-Strand breaks，DSB)，在沒有模板的條件下，發(fā)生非同源重組末端連接（Non-homologousend joining，NHEJ)，造成移碼突變（frame shift mutation)，導致基因敲除（劉志國，CRISPR-CAS9系統(tǒng)介導基因組編輯的研究進展，畜牧獸醫(yī)學報，2014-45( 10) : 167-1583)。
[0007] 與ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到純合子突變體， 而且可以在不同的位點同時引入多個突變。從質粒構建上來看，CRISPR-CAS9技術設計簡 單，操作簡便，節(jié)約成本。CRISPR-CAS9系統(tǒng)設計過程中只需改變勒基因 SgRNA的20個堿基組 成的向導序列即可，一步簡單的分子克隆即可完成。CRISPR/Cas9技術的發(fā)展十分迅猛，已 經(jīng)廣泛應用在動物的細胞水平、植物、微生物以及人類醫(yī)學等各方面。但是CRISPR-CAS9系 統(tǒng)目前也面臨著脫靶率高、特異性差的難題，這無疑是CRISPR/Cas9系統(tǒng)應用于基礎研究和 臨床治療的最大的挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明旨在提供一種CRISPR/cas9基因敲除的CYP2C11大鼠模型。
[0009] 另一個方面，本發(fā)明提供了一種基于CRISPR/cas9基因敲除技術建立CYP2C11基因 大鼠動物模型的方法，包括以下步驟： (1)確定CYP2C11大鼠待敲除基因的特異性靶位點sgRNAl和sgRNA2:使用Gene Knock-Out with Cas9軟件（南京徇齊生物技術有限公司提供），確定在CYP2C11基因 （Gene ID: 29277)的靶位點exon6內挑選2個特異性的sgRNA靶序列，這兩個靶序列分別為：sgRNAl: GCTACTGTAACTGACATGTTCSEQ. ID.NO.1)；sgRNA2：TCAAGGGTAAACTCAGACTGCSEQ. ID.NO.2)〇 CYP2C11基因長度為684bp。
[0010] (2)設計合成兩對寡聚核苷酸鏈sgRNAl和sgRNA2的引物序列：根據(jù)步驟（1 )sgRNA 靶序列，設計2對引物(南京金斯瑞生物有限公司）， Rat_CYP2Cll_c9_l-〇l(SEQ. ID. NO.3)：cacc GCTACTGTAACTGACATGTT 和Rat_CYP2Cll_c9_l-02(SEQ·ID·N0·4):aaacAACATGTCAGTTACAGTAGC ; Rat_CYP2Cll_c9_2-〇l(SEQ. ID. NO.5)：cacc TCAAGGGTAAACTCAGACTG 和Rat_CYP2Cll_c9_2-02(SEQ·ID·NO·6):aaac CAGTCTGAGTTTACCCTTGA， (3)將步驟(2)中合成的2對引物以逐步降溫(94°C_55°C)的方法退火成雙鏈，插入經(jīng) Bsal酶切好的Cas9-gRNA-Bsal載體中。載體DNA測出濃度為1000ng/mL，測序驗證插入片段 正確，將正確的克隆用作轉錄模板。
[0011] (4)將步驟（3)正確的克隆作為PCR模板，通過PCR得到帶有T7啟動子序列的 sgRNAl，sgRNA2。用T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit 試劑盒體外轉錄sgRNAl， sgRNA2。酚氯仿萃取和酒精沉降法純化轉錄產(chǎn)物。
[0012] (5)Cas9載體體外轉錄為Cas9 mRNA并進行純化：使用T7 Ultra Kit (Ambion, AM1345)試劑盒，將pST1374-cas9載體經(jīng)Agel線性化后，在體外轉錄成Cas9 mRNA。用RNeasy Mini Kit (Qiagen, 74104)試劑盒純化Cas9 mRNA。
[0013] (6)將步驟(5)構建好的cas9 mRNA與步驟(4)構建好的sgRNAl和sgRNA2,分別在斑 馬魚受精卵中檢測活性，結果顯示sgRNA2活性較