一種柱狀黃桿菌基因定向敲除質(zhì)粒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及黃桿菌遺傳操作系統(tǒng)，具體涉及一種柱狀黃桿菌基因定向敲除質(zhì)粒及 應(yīng)用，特別涉及一種遺傳操作系統(tǒng)在功能基因敲除和基因缺失弱毒疫苗構(gòu)建過(guò)程中的具體 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 柱狀黃桿菌（Flavobacteriumcolumnare)是一種革蘭氏陰性細(xì)菌。該菌能夠感 染包括人工養(yǎng)殖或野生魚(yú)類(lèi)在內(nèi)的幾乎所有不同生長(zhǎng)階段的淡水魚(yú)類(lèi)。該菌感染魚(yú)體后， 在感染部位呈柱狀生長(zhǎng)，并導(dǎo)致魚(yú)體產(chǎn)生嚴(yán)重的鰓部潰爛、背部潰瘍和鰭條壞死等一系列 癥狀，最終引起大量死亡。由該菌所引發(fā)的疾病在在我國(guó)稱(chēng)為細(xì)菌性爛鰓病，在國(guó)際上統(tǒng) 稱(chēng)為柱形病。每年春末至秋初為該病的流行盛期。我國(guó)人工養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)如草魚(yú) (Ctenopharyngodonidellus)和繼魚(yú)（Sinipercachuatsi)每年由該病引發(fā)的死亡率 可高達(dá)100% (湖北省水生生物研宄所魚(yú)病研宄室，1975;陳昌福等，1995)。在美國(guó)，每年 由該病引起人工養(yǎng)殖斑點(diǎn)叉尾鮰（letaluruspunctatus)的死亡率高達(dá)90%(Shotts& Starliper, 1999；ffagneretal. , 2002)〇
[0003] 對(duì)于該病病原柱狀黃桿菌的早期研宄主要集中在診斷（Bernardetetal. , 1996 ; Baderetal., 2003)、病理和流行病學(xué)（Foott, 2002 ;Stringer_Rothetal., 2002)和 可能的防治（.Dunhametal., 2002 ;Thomas_Jinu&Goodwin, 2004)等方面。近年來(lái)， 又有學(xué)者開(kāi)展了該菌的遺傳多樣性的研宄，現(xiàn)已證明該菌有三個(gè)基因組型Oarwish& Ismaiel，2005;Schneck&Caslake，2006;Wangetal.，2010)。近年來(lái)，盡管柱狀黃桿菌 的基因組序列已經(jīng)公布，研宄人員也嘗試開(kāi)展可能的毒力因子和致病機(jī)理的研宄，但是尚 未取得突破性進(jìn)展。這主要?dú)w因于在該研宄領(lǐng)域缺乏一套適合柱狀黃桿菌的遺傳操作系 統(tǒng)。
[0004] 目前，在許多致病菌如致病性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、愛(ài)德華氏菌中，均有一套完善 的可用于毒力因子和致病機(jī)理研宄的遺傳操作系統(tǒng)?？赏ㄟ^(guò)缺失突變的手段對(duì)目的基因進(jìn) 行敲除和功能互補(bǔ)，從而深入開(kāi)展對(duì)目的基因的功能研宄并闡明其在細(xì)菌致病過(guò)程中所發(fā) 揮的作用。而在柱狀黃桿菌的研宄過(guò)程中，由于缺乏合適的遺傳操作系統(tǒng)，目前只能實(shí)現(xiàn)對(duì) 目的基因進(jìn)行同源重組和插入失活（Starosciketal，2008;Zhangetal.，2012)，對(duì)于目 的基因進(jìn)行定向敲除和功能互補(bǔ)一直未能取得成功。因此，也限制和阻礙了對(duì)該菌在毒力 因子、致病機(jī)理和制備毒力基因缺失弱毒疫苗的研宄。
[0005] 本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一個(gè)能夠用于黃桿菌尤其是柱狀黃桿菌目的基因的開(kāi)放 閱讀框內(nèi)突變、真正實(shí)現(xiàn)目的基因的定向敲除和非極性缺失突變的質(zhì)粒，并優(yōu)化一種使用 該質(zhì)粒開(kāi)展研宄的方法。從而為深入開(kāi)展對(duì)該菌功能基因的研宄、闡明致病機(jī)理和制備毒 力基因缺失弱毒疫苗提供一個(gè)有利的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種柱狀黃桿菌基因定向敲除質(zhì)粒pMS75(本發(fā)明或稱(chēng)自殺 質(zhì)粒）。該質(zhì)粒共由7715個(gè)堿基對(duì)組成（SEQIDNO. 1所示），其中包含了在大腸桿菌中復(fù) 制所需的復(fù)制區(qū)域和能夠正常表達(dá)的抗性基因；在柱狀黃桿菌中能夠正常表達(dá)的抗生素抗 性基因和負(fù)選擇標(biāo)記基因（SEQIDN0. 2所不序列包含所述的負(fù)選擇標(biāo)記基因）。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種柱狀黃桿菌基因定向敲除質(zhì)粒的應(yīng)用。運(yùn)用本 發(fā)明所獲得的質(zhì)粒，通過(guò)將待缺失基因的上下游序列克隆至載體并導(dǎo)入柱狀黃桿菌，可在 該菌中發(fā)生兩次同源重組，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的框內(nèi)缺失突變和功能敲除。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施：
[0009] -種柱狀黃桿菌基因定向敲除質(zhì)粒，制備方法包括：
[0010] (1)穿梭質(zhì)粒pCP23(Agaral et al，1997)改造為線性載體
[0011] 可通過(guò)兩種方法進(jìn)行：一是將分離純化的穿梭質(zhì)粒PCP23用SacI和Kpnl進(jìn)行雙 酶切，電泳結(jié)束后將大小為6103bp的片段切下，回收后即為pCP23線性載體。二是用引物 擴(kuò)增穿梭質(zhì)粒PCP23的除黃桿菌復(fù)制區(qū)域以外的序列。該載體置4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0012] (2)含負(fù)選擇標(biāo)記的自殺質(zhì)粒的構(gòu)建
[0013] 將SEQIDN0. 2所示核苷酸序列（含有負(fù)選擇標(biāo)記基因片段）與pCP23線性載體 定向連接。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用氨芐青霉素的LB平板篩選目的菌落。挑取目的 菌落在氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，即得一種柱狀黃桿菌基因定向敲除質(zhì)粒 PMS75,本發(fā)明或稱(chēng)為自殺質(zhì)粒，其序列為SEQIDNO. 1所示。
[0014] 一種柱狀黃桿菌基因定向敲除質(zhì)粒的應(yīng)用，包括利用該質(zhì)粒定向敲除柱狀黃桿菌 的目的基因構(gòu)建基因缺失株；或構(gòu)建柱狀黃桿菌基因缺失弱毒疫苗。
[0015] 具體操作過(guò)程包括：
[0016] (1)確定待缺失DNA序列
[0017] 通過(guò)生物信息學(xué)分析以確定待缺失的基因的功能結(jié)構(gòu)域，并初步確定待缺失的 DNA片段長(zhǎng)度。
[0018] (2)待缺失DNA序列的上游序列選擇（本發(fā)明或稱(chēng)為A片段）
[0019] 用于同源重組的待缺失DNA的上游序列需大于或等于1.8kb且小于或等于2.5kb， 其中目的基因開(kāi)放閱讀框的第一個(gè)堿基至待缺失DNA序列之前的最后一個(gè)堿基應(yīng)為3的倍 數(shù)。
[0020] (3)待缺失DNA序列的下游序列選擇（本發(fā)明或稱(chēng)為B片段）
[0021] 用于同源重組的待缺失DNA的下游序列需大于或等于1.8kb且小于或等于2.5kb， 其中待缺失DNA序列之后的第一個(gè)堿基至目的基因開(kāi)放閱讀框的最后一個(gè)堿基應(yīng)為3的倍 數(shù)。
[0022] (4)將待缺失DNA區(qū)域的上下游序列克隆至含負(fù)選擇標(biāo)記的自殺質(zhì)粒
[0023] 通過(guò)酶切連接法將待缺失DNA序列的上下游序列（A、B片段）克隆至自殺質(zhì)粒。
[0024] 具體的，將A、B片段克隆至自殺質(zhì)粒的方法包括：PCR方法擴(kuò)增A片段時(shí)，在A片段 的正反向引物上各引入一個(gè)酶切位點(diǎn)，這兩個(gè)酶切位點(diǎn)應(yīng)不相同；在擴(kuò)增B片段時(shí)，在B片 段的正反向引物上也分別引入一個(gè)酶切位點(diǎn)，其中B片段的正向引物的酶切位點(diǎn)應(yīng)與A片 段反向引物的酶切位點(diǎn)相同。通過(guò)酶切連接的方法將A或B片段通過(guò)酶切、連接的方法連 入自殺質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將篩選得到的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后，同法將B或A片段連入 該質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，通過(guò)氨芐青霉素平板篩選和PCR檢測(cè)確定含A、B片 段的自殺質(zhì)粒的大腸桿菌陽(yáng)性菌株。將該大腸桿菌菌株大量培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒即可得到含 待缺失DNA上下游同源序列的自殺質(zhì)粒。
[0025] (5)將含待缺失DNA序列上下游同源序列的自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)入柱狀黃桿菌
[0026] 將上一步提取到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到能夠進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移的大腸桿菌（Escherichia coli)菌株如SM10或S17-1A中。將該含該質(zhì)粒的大腸桿菌菌株與柱狀黃桿菌等體積培養(yǎng) 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期，離心收集菌體。用Shieh培養(yǎng)基將兩種菌體分別洗滌兩次后混合重懸，懸 液滴至預(yù)先鋪有滅菌NC膜的Shieh平板上。將該平板在28°C靜置培養(yǎng)20-24h。
[0027] (6)篩選在柱狀黃桿菌中發(fā)生第一次同源重組的菌株
[0028] 將完成接合轉(zhuǎn)移的細(xì)菌混合物從NC膜上刮下來(lái)，并用不含抗生素的Shieh培養(yǎng)基 重懸。懸液涂布含抗生素的Shieh平板，28°C靜置培養(yǎng)至有菌落長(zhǎng)出。此時(shí)長(zhǎng)出的菌落即 為發(fā)生第一次同源重組后的菌株。
[0029] (7)篩選在柱狀黃桿菌中發(fā)生第二次同源重組的菌株
[0030] 將發(fā)生第一次同源重組的菌株在無(wú)抗生素的Shieh液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期，用該菌液涂布含10%蔗糖的Shieh平板。待菌落長(zhǎng)出后，挑選單菌落培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期。將該培養(yǎng)物分別在含四環(huán)素和不含四環(huán)素的平板上劃線培養(yǎng)。在兩種平板上都能生長(zhǎng) 的菌株丟棄；將只能在不含四環(huán)素的Shieh平板上生長(zhǎng)的該菌株保留供進(jìn)一步篩選。
[0031] (8)缺失突變株篩選和確認(rèn)
[0032] 用待缺失DNA區(qū)域的序列為模板設(shè)計(jì)引物，菌液PCR方法擴(kuò)增發(fā)生同源重組的菌 株，如果擴(kuò)增到目的條帶，表明該菌株回復(fù)野生型，應(yīng)丟棄；如果未能擴(kuò)增到目的條帶，表明 該菌株可能已發(fā)生缺失突變，保留該菌株供進(jìn)一步檢測(cè)和確認(rèn)。
[0033] 用待缺失DN