材料選擇性的遞送至細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】根據(jù)所述細(xì)胞的物理性質(zhì)分離或鑒別一種細(xì)胞能夠包括提供一種細(xì)胞懸浮液；使懸浮液通過一種含有收縮部分的微流體通道；使細(xì)胞懸浮液通過收縮部分；并且，使所述細(xì)胞懸浮溶液與一種化合物進(jìn)行接觸。所述收縮部分被調(diào)節(jié)尺寸從而與相對較小的細(xì)胞相比優(yōu)先使一種相對較大的細(xì)胞變形。
【專利說明】材料選擇性的遞送至細(xì)胞
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求享有2013年8月16日提交的美國臨時專利申請?zhí)枮?1/866,972的權(quán)益，該申請的全部內(nèi)容已經(jīng)通過引用并入本文。
[0003]政府支持
[0004]本發(fā)明獲得由美國國立衛(wèi)生研究院授予的R01GM101420-01A1，美國國立衛(wèi)生研究院授予的RC1EB011187-02，國立癌癥研究所授予的P30-CA-14051，以及國家科學(xué)基金會授予的GRFP主要基金號為#1122374的政府支持。該政府部門在本發(fā)明中享有某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005]本發(fā)明領(lǐng)域涉及材料的尺寸選擇性遞送至細(xì)胞。
[0006]發(fā)明背景
[0007]材料的細(xì)胞內(nèi)遞送是一種挑戰(zhàn)。依賴于納米顆粒、電場、成孔化學(xué)等的現(xiàn)有技術(shù)能夠遞送一些材料到某些細(xì)胞類型中，但是通常針對目標(biāo)細(xì)胞的物理特性是以完全無差別方式進(jìn)行。通過發(fā)展依賴于目標(biāo)細(xì)胞的生物特性的選擇性遞送方法，人們能夠在研究、診斷或者治療應(yīng)用的遞送活性中運(yùn)用多種更為有效的控制。舉例來說，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是在血液中發(fā)現(xiàn)的認(rèn)為是介導(dǎo)轉(zhuǎn)移、或者癌癥的擴(kuò)散的腫瘤細(xì)胞，到身體中的較遠(yuǎn)位點(diǎn)。大約90%的由于癌癥導(dǎo)致人類死亡是由于轉(zhuǎn)移。CTC的識別與特征是用于理解、治療或者預(yù)防轉(zhuǎn)移癌癥的關(guān)鍵。此外，本領(lǐng)域眾所周知相對于周圍血細(xì)胞而言這些細(xì)胞具有不同的物理特性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明主題提供了基于物理特性用于選擇性為一種或多種細(xì)胞遞送材料的裝置、系統(tǒng)和方法，所述物理特性例如是尺寸、體積、直徑、胞液粘度或膜硬度。舉例來說，材料可以以細(xì)胞尺寸依賴的方式進(jìn)行遞送。含有不同尺寸細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液可穿過有目標(biāo)遞送材料(例如，染料，蛋白質(zhì)，核苷酸等等)存在的裝置，并且這些材料能夠選擇性地遞送到在種群中的較大細(xì)胞。通過較大細(xì)胞的細(xì)胞膜的選擇性破壞的數(shù)據(jù)中的遞送機(jī)制是因?yàn)槠涫窃谕ǖ朗湛s部分中變形，而較小的細(xì)胞不會變形從而足以引起膜破壞。
[0009]在一些示例性應(yīng)用中，能夠得到相對于非腫瘤細(xì)胞而言標(biāo)記的細(xì)胞。細(xì)胞通過一種裝置用于使用熒光染料或者其他檢測的標(biāo)記物進(jìn)行尺寸選擇性標(biāo)記。所述細(xì)胞任選用抗體進(jìn)行染色，例如腫瘤細(xì)胞選擇性抗體比方說抗CD45抗體，從而提供在癌癥細(xì)胞和血細(xì)胞(大部分血細(xì)胞是⑶45+)之間的進(jìn)一步對比。樣品通過一種細(xì)胞分選器，例如一種標(biāo)準(zhǔn)熒光活化細(xì)胞分選器(FACS)。
[0010]在一些示例性應(yīng)用中，能夠得到依據(jù)它們的細(xì)胞周期的細(xì)胞的標(biāo)記，因?yàn)樵诘姆N群中接近分裂的細(xì)胞比那些剛剛經(jīng)歷過分裂的細(xì)胞更大。向在種群中的較大細(xì)胞的染料的遞送能夠用于鑒定在細(xì)胞周期較后面的階段過程中的單個細(xì)胞。
[0011]在一些示例性應(yīng)用中，用于血癌(例如淋巴瘤)的治療可以實(shí)現(xiàn)，因?yàn)榱馨土黾?xì)胞通常比周圍血液細(xì)胞大，因此一種細(xì)胞內(nèi)毒素能夠遞送到淋巴瘤細(xì)胞中而不是健康的周圍血細(xì)胞中。從而，這可以誘導(dǎo)患病細(xì)胞的選擇性地死亡。
[0012]標(biāo)記的細(xì)胞可以通過熒光或者磁性純化技術(shù)進(jìn)行分離。使用機(jī)器人操縱的流式細(xì)胞儀或者微陣列能夠被用于根據(jù)熒光性選擇細(xì)胞，同時能夠使用磁鐵柱、微流分離系統(tǒng)、或磁力清掃器來分離磁標(biāo)記的顆粒。
[0013]細(xì)胞可以基于相對尺寸或者直徑從而進(jìn)行識別。因此，相對較大的細(xì)胞選擇性地或者優(yōu)先地選取標(biāo)記，這是由于在較大的細(xì)胞中細(xì)胞膜的破壞程度相對較大，即，相對于較小的細(xì)胞，較大的細(xì)胞以一種較大程度進(jìn)行變形。由于較大細(xì)胞的較大程度的細(xì)胞膜破壞，相對于較小細(xì)胞而言，至少10 %、25 %、50 %、2-倍、5-倍、10-倍、100-倍或者更多的有效負(fù)載分子獲取進(jìn)入到較大細(xì)胞的內(nèi)部(細(xì)胞質(zhì))。作為根據(jù)上述的方式的可檢測的標(biāo)記的攝取的結(jié)果以及按照標(biāo)記的攝取進(jìn)行的后續(xù)分類，與在外周血中的純度水平相比，多種腫瘤細(xì)胞可被增強(qiáng)100倍、I，000倍、或者高達(dá)10，000倍或者更多。純度的評估是通過靶向/連接到已知標(biāo)記上的抗體進(jìn)行的，其中所述標(biāo)記通過腫瘤細(xì)胞被表達(dá)/過表達(dá)?？蛇x擇地，針對標(biāo)記的抗體，沒有被腫瘤細(xì)胞所表達(dá)，但是會被血細(xì)胞所表達(dá)/過表達(dá)(CD45是一個示例)。兩種方式都有助于提供增加的對比度從而分類所感興趣的細(xì)胞。
[0014]具有高尺寸-標(biāo)記熒光和低⑶45熒光的樣品被捕獲作為候選/潛在的CTC13FACS輸出在本質(zhì)上是相對的。一種“高”信號在基線控制信號至少的熒光強(qiáng)度的最小的十進(jìn)位(十倍較高的水平)，并且一種“低”信號是在陽性控制種群之下的十進(jìn)位。
[0015]本發(fā)明所述的裝置和方法提供了一種解決方案，用于解決用于怎樣從來源于患者的血液樣本中的1-10百萬的白血球中識別和/或分離大約I或者更多(2、5、10、100、1,000或者更多)的CTC的這一長期存在的問題。例如，每毫升血液ICTC是與癌癥患者臨床相關(guān)的。綜上所述，用于分離或者識別一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法包括提供一種細(xì)胞懸浮液的步驟;使溶液通過微流體通道，所述微粒體通道包括收縮部分，所述收縮部分調(diào)節(jié)尺寸用于優(yōu)選地使循環(huán)的腫瘤細(xì)胞變形，而不是白細(xì)胞變形;使細(xì)胞懸浮液通過收縮部分;并且是細(xì)胞懸浮溶液與可檢測標(biāo)記進(jìn)行接觸。所述溶液可通過一種微流體通道，所述微流體通道包括一種收縮部分，所述收縮部分被調(diào)節(jié)尺寸從而優(yōu)選地將一種化合物遞送到具有與其他細(xì)胞組相比相對不同的物理特性的細(xì)胞組中。所述物理特性可以包括細(xì)胞尺寸、直徑、胞液濃度和/或細(xì)胞膜硬度(例如通過傳送時間測定法進(jìn)行測定，較硬的細(xì)胞通過給定的微通道與較為不硬的細(xì)胞相比更慢，如在Sharei et al.,2012,Anal.Chem.84(15):6438-6443;Cross etal.,2007,Nature Nanotechnology2:780-783中所描述的那樣)。所述接觸可以發(fā)生在變形治療之后?；蛘咚霾牧峡梢栽谧冃沃委熤芭c細(xì)胞進(jìn)行預(yù)混合。CTC和白血球都會變形；但是，較大的細(xì)胞變形至一種較大程度并且因此，分子可選擇性地遞送到這些細(xì)胞中，從而治療或者標(biāo)記它們。
[0016]舉例來說，所述標(biāo)記包括一種可檢測標(biāo)記的，例如，熒光性或者磁性示蹤的材料，例如一種染料或者顆粒。所述染料或者顆粒不需要是腫瘤特異性的。可選擇地，它們差異地連接到腫瘤細(xì)胞上(例如，與非腫瘤細(xì)胞相比，至少20 %、50 %、2倍、5倍或者更多)。但是，所述方法的特異性是依據(jù)一種發(fā)現(xiàn)，其中腫瘤細(xì)胞比白血球稍大，并且所述裝置具有高度尺寸選擇性。這種尺寸差異依賴于腫瘤類型。例如，腫瘤細(xì)胞通常比白血球大50%-400%。因此，所遞送的材料優(yōu)選地進(jìn)入到細(xì)胞中，所述細(xì)胞是足夠大的從而能夠通過細(xì)胞的尺寸特異性變形而被標(biāo)記。然后所遞送的標(biāo)記再依次被檢測從而識別CTC。
[0017]在一個實(shí)施例中，所述懸浮液包括全血。作為選擇地，所述細(xì)胞懸浮液是一種細(xì)胞的混合物，其在生理鹽水溶液中而不是全血中。典型地，所述細(xì)胞懸浮液包括具有患有腫瘤細(xì)胞風(fēng)險或者具備被診斷為具有腫瘤的受試者的全血。例如，患者懷疑具有、被診斷具有、或者懷疑或診斷患有黑色素瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、腦或血液的轉(zhuǎn)移性疾病。因此，CTC的早期檢測在臨床上是重要的，因?yàn)檫@種檢測表示一種可能向轉(zhuǎn)移性疾病反向發(fā)展的患者的早期識別。
[0018]可選擇地，在這些細(xì)胞通過所述裝置之前，完成紅細(xì)胞溶解作為一種預(yù)處理步驟。
[0019]所述裝置的特征在于使腫瘤細(xì)胞區(qū)別于非腫瘤細(xì)胞(例如，正常的紅細(xì)胞或者白細(xì)胞)的物理參數(shù)。舉例來說，收縮部分包括從4μπ?-10μπ?的寬度，Ιμ??-ΙΟΟμπ?的長度以及串聯(lián)的1-10個收縮部分。細(xì)胞的估算速度可以是在10mm/s至10m/s的范圍內(nèi)。為了推進(jìn)或者推動所述細(xì)胞懸浮液通過裝置，所述方法進(jìn)一步包括將一種壓力施加至細(xì)胞。壓力被用于趨勢細(xì)胞懸浮液通過裝置，并且通過收縮點(diǎn)的傳輸是使細(xì)胞變形并且導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，并且進(jìn)而遞送。
[0020]所述方法包括將一種可檢測的化合物誘導(dǎo)至腫瘤細(xì)胞中。因此，所述細(xì)胞懸浮液包括一種有效負(fù)載，或者所述方法進(jìn)一步包括，在其通過收縮部分之后，在一種含有有效負(fù)載的溶液中培養(yǎng)所述細(xì)胞懸浮液一段預(yù)設(shè)的時間。舉例來說，所述有效負(fù)載包括磁性顆粒例如納米顆粒、熒光顆粒例如一種量子點(diǎn)或者碳納米管、或者熒光染料或者蛋白質(zhì)、或者針對熒光蛋白編碼的基因材料(DNA或者RNA)或者其他能夠檢測的化合物(例如熒光素酶)ο可替代的，可以遞送上述材料的組合，從而完成檢測以及細(xì)胞的同時操作。舉例來說，能夠遞送一種熒光顆粒從而完成排序和共遞送DNA、RNA或者蛋白質(zhì)，從而方便隨后的腫瘤細(xì)胞的生存并且刺激它們的生長和增殖分選后，從而使得能夠進(jìn)一步的對培養(yǎng)的轉(zhuǎn)移細(xì)胞的研究。
[0021]在本發(fā)明中，還涉及以一種用于從非腫瘤細(xì)胞區(qū)分腫瘤細(xì)胞的系統(tǒng)，包括定義了內(nèi)腔的微流體通道，并且被配置從而使懸浮在緩沖液中的腫瘤細(xì)胞能夠經(jīng)此通過，并且與非腫瘤細(xì)胞相比對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行收縮。非腫瘤細(xì)胞可以被變形到某些程度;但是，關(guān)鍵在于對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行變形從而足以致使細(xì)胞膜破裂，反之非腫瘤細(xì)胞由于其較小的相對尺寸從而不會進(jìn)行足以致使細(xì)胞膜破裂的變形。較小細(xì)胞的細(xì)胞膜不會被破壞或者相比于較大的細(xì)胞的細(xì)胞膜而言破壞較少。例如，在某些情況下，較大和較小細(xì)胞都會被破壞但是較小的細(xì)胞相對于較大的細(xì)胞會吸收較少的材料。微流體通道包括細(xì)胞變形收縮部分，其中所述收縮部分的直徑是細(xì)胞直徑的函數(shù)。所述收縮部分進(jìn)行尺寸化從而相比于非腫瘤細(xì)胞會優(yōu)先地使腫瘤細(xì)胞變形。這種優(yōu)選變形被設(shè)計(jì)為選擇性地促進(jìn)目標(biāo)材料遞送的腫瘤細(xì)胞，與非腫瘤細(xì)胞相比。選擇性的遞送使得一種物質(zhì)富集在期望的腫瘤種群中，通過分揀/富集方法，例如流式細(xì)胞儀(FACS)、顯微操縱、磁力分離、細(xì)胞培養(yǎng)。
[0022]該方法是在生理學(xué)溫度下完成，例如37°C，室溫下，例如20°C，或者任選的在0_4°C溫度下。在某些情況中，后者是優(yōu)選的，因?yàn)槠淠軌虍a(chǎn)生較好的遞送性能，由于延遲細(xì)胞膜修復(fù)并且通過降低細(xì)胞的內(nèi)吞活性從而最大程度減小內(nèi)吞作用的背景。根據(jù)上文所述，細(xì)胞懸浮液是全血或者在作為遞送緩沖液的生理緩沖溶液(例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或組織培養(yǎng)基)中的任何哺乳動物細(xì)胞懸浮液。在某些實(shí)施例中，PBS是優(yōu)選的，因?yàn)榻档土嗽诮M織培養(yǎng)基上的Ca或者M(jìn)g的作用。
[0023]在一個方面，根據(jù)細(xì)胞的物理性質(zhì)分離或者識別一種細(xì)胞可以包括提供一種細(xì)胞懸浮液;是懸浮液通過包括收縮部分的微流體通道;使細(xì)胞懸浮液通過收縮部分;并且使細(xì)胞懸浮溶液與化合物接觸。收縮部分能夠被尺寸化從而優(yōu)選地使與相對較小的細(xì)胞相比相對較大的細(xì)胞進(jìn)行變形。
[0024]在另一個方面，用于從非腫瘤細(xì)胞中區(qū)分腫瘤細(xì)胞的微流體系統(tǒng)可以包括一種微流體通道，所述微流體通道定義一種內(nèi)腔并且被配置從而與非腫瘤細(xì)胞相比使懸浮在緩沖液中的腫瘤細(xì)胞通過并且被收縮。所述微流體通道可以包括一種細(xì)胞變形收縮部分。收縮部分的直徑可以是細(xì)胞直徑的函數(shù)。
[0025]可以包括下述特征中的一個或多個。例如，物理特性可以是尺寸和直徑中的一個或多個。細(xì)胞懸浮液能夠包括下一種或多種:外周血細(xì)胞；以及具有不同物理特性的至少兩種不同細(xì)胞尺寸。細(xì)胞懸浮液可以包括外周血細(xì)胞的紅細(xì)胞耗盡的群。較大的細(xì)胞可以包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并且較小的細(xì)胞可以包括白血球O化合物可以包括0.5kDa至5Mda的分子量?；衔锟梢园?kDa至I OkDa的分子量。化合物可以包括一種可檢測的標(biāo)記物(例如，量子點(diǎn)、青色素、熒光素、若丹明、以及它們的衍生物，比方說異硫氰酸熒光素(FITC)或者四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)或者NHS-羅丹明，馬來酰亞胺活化的熒光素比如說熒光素-5-馬來酰亞胺，以及Alexa熒光劑)，活性生物分子、和/或毒素(例如，假單胞菌外毒素、白喉毒素、和蓖麻毒素，caspase蛋白質(zhì)，干擾基本細(xì)胞功能的抗體(例如，抗微管蛋白抗體))，用于選擇性地殺死目標(biāo)細(xì)胞。所述化合物能夠影響細(xì)胞功能(例如，轉(zhuǎn)錄因子、s iRNA、DNA、mRNA、抗體、小分子藥物)和/或能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。所述化合物能夠在細(xì)胞通過收縮部分之后進(jìn)入到細(xì)胞中。所述懸浮液可以包括全血。所述懸浮液可以包括患有包括腫瘤風(fēng)險的受試者或者診斷具有腫瘤的受試者的全血。所述腫瘤可以包括黑色素瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、腦癌、或血液癌癥。所述收縮部分可以包括的寬度為4μπι-1 Ομπι，長度為1μπι-100μπι，以及串聯(lián)的1-10個收縮部分。細(xì)胞通過收縮部分的速度可以是在lOmm/s至lOm/s的范圍內(nèi)。能夠?qū)毫?yīng)用于細(xì)胞懸浮液從而驅(qū)使細(xì)胞通過微流體通道的收縮部分。
[0026]所述細(xì)胞懸浮液可以包括一種有效載荷，或者所述細(xì)胞懸浮液可以在其通過收縮部分之后在預(yù)定的時間內(nèi)在含有有效載荷的溶液中進(jìn)行溫育。所述有效載荷可以包括磁性顆粒、熒光顆粒、例如量子點(diǎn)或者碳納米管、或者熒光染料或蛋白質(zhì)、或者編碼熒光蛋白的遺傳物質(zhì)(DNA或者RNA)或者其他能夠檢測的化合物(例如，熒光素酶)。所述收縮部分可以進(jìn)行尺寸化從而與非腫瘤細(xì)胞相比優(yōu)先使腫瘤細(xì)胞變形。
[0027]本發(fā)明的這些和其他能力連通本發(fā)明本身在重新仔細(xì)查看下列附圖、詳細(xì)描述和權(quán)利要求書得到全面的理解。
【附圖說明】
[0028]附圖1指的是用于通過快速機(jī)械變形的尺寸選擇標(biāo)記CTC的系統(tǒng)的框圖。
[0029]附圖2是柱狀圖，其顯示了將尺寸選擇遞送微流體平臺與用于CD45染色的抗體進(jìn)行結(jié)合會產(chǎn)生樣品富集因子，比獨(dú)立地其他技術(shù)好超過一個量級。
[°03°]附圖3A是一種細(xì)胞標(biāo)記的示意圖。使用標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞裂解試劑例如eB1scienceRBC裂解緩沖液(Cat.N0.00-4333)使紅血細(xì)胞(RBCs)通過RBC細(xì)胞溶解從全血中被消耗。所得到的懸浮液流過收縮通道微流體裝置，用熒光染料(以及任選其他化合物)進(jìn)行溫育。然后將所述懸浮液用⑶45進(jìn)行標(biāo)記，并且在熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)機(jī)器上進(jìn)行處理從而收集具有用熒光染料標(biāo)記的非-CD45+細(xì)胞。
[0031]附圖3B是一系列共軛3kDa右旋糖酐的cascade藍(lán)的流式細(xì)胞素計(jì)數(shù)點(diǎn)，通過CellSqueeze裝置遞送至PBMCs (在50psi下的30-6個芯片)、HT-29(在50psi下的30-6個芯片)、SK-MEL-5 (在50ps i下的10_7個芯片)以及PANC-1 (在50ps i下的10_7個芯片)。
[0032]附圖3C是在通過收縮通道之前和之后的一系列Panc-1腫瘤細(xì)胞和血細(xì)胞的透射光和熒光顯微圖。預(yù)遞送的細(xì)胞是在染料存在下進(jìn)行溫育，用于矯正背景胞吞作用。所述后遞送圖像是在遞送后24個小時拍照從而證明染料的滯留和細(xì)胞在遞送后細(xì)胞的粘附和生長能力。雖然大的血細(xì)胞還可以在處理中得到標(biāo)記，但是這些數(shù)據(jù)證明了腫瘤細(xì)胞的選擇性標(biāo)記。
[0033]附圖4是與在PBMC和淋巴瘤混合物中的百分I3BMC相比I3BMC遞送的圖，顯示了與健康的PBMC相比染料選擇性遞送至腫瘤細(xì)胞。即使當(dāng)所述懸浮液是以數(shù)量級99.9%健康的PBCM時，在某些實(shí)施中能夠?qū)崿F(xiàn)高達(dá)8倍的遞送特異性。在另一些實(shí)施中，能夠?qū)崿F(xiàn)更高的特異性。
[0034]附圖5A是加入到全血(40細(xì)胞/ml)并且用⑶45復(fù)染法(APC)處理的四甲基若丹明右旋糖酐標(biāo)記的Panc-1-GFP細(xì)胞的FACS圖。
[0035]附圖5B是GFP與CD45相比的FACS圖，證明根根據(jù)GFP熒光PANC-1GFP標(biāo)記怎樣能夠單獨(dú)地被證實(shí)。P5的柵極將被作為用于排序候選CTC的基礎(chǔ)，P4被用于證實(shí)PANC-1GFP細(xì)胞的標(biāo)識。綠色的點(diǎn)是精確命中(P4&P5)，紅色的點(diǎn)是假陽性(僅有P5 )，藍(lán)色的點(diǎn)是未命中(僅有 P4)0
[0036]附圖5C是HTB1760的原發(fā)腫瘤的組織病理學(xué)圖像，確定胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)。具體實(shí)施方案
[0037]CTC是腫瘤細(xì)胞，其在血液中被發(fā)現(xiàn)，并且被認(rèn)為是癌癥轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端器官的原因。CTC被認(rèn)為是對于癌癥患者最小侵入性的、“液體活組織檢查”，并且是作為用于患者預(yù)后和治療功效的預(yù)后指標(biāo)。這些單一細(xì)胞的全面表征提供了轉(zhuǎn)移性轉(zhuǎn)移、治療性抵抗和腫瘤生物學(xué)的更高的理解。
[0038]典型的人的紅細(xì)胞具有大約6.2-8.2μπι直徑的圓盤，以及在2_2.5μπι的最厚點(diǎn)的厚度;并且在0.8-1μπι中心的最小厚度，比大多數(shù)其他人類細(xì)胞小的多。白細(xì)胞(白血細(xì)胞)包括中心粒細(xì)胞(12-14μπι直徑)、嗜酸粒細(xì)胞(12-17μπι直徑)、嗜堿粒細(xì)胞(I4-16μπι直徑)、淋巴細(xì)胞(對于靜止的直徑為平均6_9μπι，并且對于激活的直徑為10-14μπι)、以及單核細(xì)胞，最大類型的白血細(xì)胞可以在直徑上高達(dá)20μπι。如附圖1所示，在CTC和血液細(xì)胞之間的尺寸差異通常允許從在循環(huán)血液(CTCs?9-20ym;RBC?8μπι盤形；白細(xì)胞?7-12μπι)中的其他細(xì)胞區(qū)分CTC。參見附圖1。隨后使用抗體(或者其細(xì)胞特異性片段)特異性標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞或者其他腫瘤細(xì)胞特異性配體提高了方法的選擇性。
[0039]由于CTC是作為一種在血流中的16-1O7單核細(xì)胞中存在，所以使用了高靈敏度富集技術(shù)其依賴于從血細(xì)胞中在CTC方面的免疫學(xué)或者形態(tài)學(xué)的差異。免疫學(xué)方法通常針對上皮細(xì)胞表面標(biāo)記(例如EpCAM)以及腫瘤特異性蛋白(例如Her2-neu、MUC I/MUC2、癌胚抗原(CEA)、乳腺球蛋白、以及甲胎蛋白)或者用于消除CD45+細(xì)胞的目的。微過濾、密度梯度分離和微流體平臺是以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的方法的示例。CTC的所有這些方法可能下調(diào)表面抗原或者表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征。這些偏見造成該領(lǐng)域的顯著挑戰(zhàn)，因?yàn)樗鯟TC的子集是對于新陳代謝負(fù)責(zé)或者是可靠地預(yù)后標(biāo)記仍然很大程度上是未知的。因此，開發(fā)能夠確保所有候選CTC子類型的高靈敏度方案用于拍攝最為臨床相關(guān)的候選物是非常重要的。在這里所描述的裝置和方法允許感興趣的CTC子類型的分離和計(jì)數(shù)。
[0040]—種組合富集的方法結(jié)合了免疫學(xué)和形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)的方法，用于標(biāo)記和分離具有較少偏差的純的CTC，并且基于可調(diào)的參數(shù)。所屬方法結(jié)合了微流體細(xì)胞內(nèi)遞送(附圖1)和抗體染色，用于從全血中產(chǎn)生穩(wěn)定的、高靈敏度純化的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(附圖2)，包括一種4μ-10ym寬，Ιμ??-ΙΟΟμπι長，以及1-10個串聯(lián)的收縮部分。細(xì)胞的估算速度可以為從10mm/s至10m/s的范圍內(nèi)。所選擇的具體的裝置參數(shù)是有目標(biāo)腫瘤細(xì)胞類型所決定的，例如，不同的裝置設(shè)計(jì)被用來針對黑色素瘤患者或者是結(jié)腸癌患者進(jìn)行CTC的選擇。腫瘤細(xì)胞尺寸/直徑的實(shí)施例包括:黑色素瘤?15um，結(jié)腸癌?11um，以及胰腺癌?15um。
[0041]在這種方法中，一種快速機(jī)械變形遞送系統(tǒng)利用在多種CTC和周圍血細(xì)胞之間固有的尺寸差異用于選擇性地將熒光、磁性和/或其他的區(qū)別材料遞送至腫瘤細(xì)胞。在進(jìn)一步的過程中，基于抗體的熒光和/或磁性標(biāo)記被用于增強(qiáng)候選CTC和周圍血細(xì)胞之間的對比。通過唯一地將基于尺寸和免疫學(xué)的方法與CTC分離結(jié)合，這種技術(shù)證明了用于分析的從患者樣本中無偏置分離候選腫瘤細(xì)胞的作用。在某些實(shí)施方案中，較大和較小的細(xì)胞都能夠進(jìn)行變形，但是較小的細(xì)胞膜不會被變形至細(xì)胞膜受損的那一點(diǎn)。例如，為了選擇性地遞送至在全血細(xì)胞中的15μπι的腫瘤細(xì)胞，其中大部分健康的白細(xì)胞是?8μπι的尺寸時，可以使用一種6μπι寬的收縮部分。這種收縮部分將會同時時兩種類型的細(xì)胞變形，但是將更優(yōu)選地使15μηι的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜擾亂，而不是8μηι的血細(xì)胞。
[0042]臨床/轉(zhuǎn)移相關(guān)性
[0043]目前正在探索將CTC作為用于腫瘤活檢的替代指標(biāo)，用于了解抗性機(jī)制并且指導(dǎo)靶向療法的選擇。治療前和治療后的CTC的數(shù)量和組合物的測量表明治療效果和預(yù)后。所述方法利用了一種穩(wěn)定的、高通量的、一次性的裝置，用于根據(jù)細(xì)胞尺寸和表面抗原進(jìn)行CTC的標(biāo)記。此外，遞送各種大分子的能力還能夠使其遞送分子探針(例如，抗體、量子點(diǎn)、碳納米管、以及分子信標(biāo))，其對細(xì)胞內(nèi)環(huán)境進(jìn)行應(yīng)答，并且因此提供為目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)特性提供進(jìn)一步的信息。這種組合方法提供了一種穩(wěn)定的平臺，能夠?qū)δ切﹥H僅依靠免疫學(xué)或形態(tài)學(xué)分離的替代方法已經(jīng)錯過的CTC種群進(jìn)行富集。該技術(shù)有利于分離患者的CTC。
[0044]實(shí)施例1
[0045]全血或者其他的細(xì)胞懸浮液同時使用未標(biāo)記的和/或抗體包覆的磁珠進(jìn)行處理。然后使用一種作用于罕見的細(xì)胞的高保真、磁性富集系統(tǒng)對這些細(xì)胞進(jìn)行分離。也可以使用一種納米孔技術(shù)用于通過從84，672亞納米級的孔的彈性陣列中對所需要的單個細(xì)胞進(jìn)行成像和自動檢索從而實(shí)現(xiàn)高純度的分離。
[0046]得到不同表型的單一、活的、純凈、完整的CTC允許表征的宿主從基因組到具有立即臨床和轉(zhuǎn)移相關(guān)性的功能水平努力。該方法允許一種具有降低偏差的活的、不同的CTC的高度敏感性和特異性富集。
[0047]實(shí)施例2
[0048]磁性納米顆粒被遞送至腫瘤細(xì)胞系&PBMCS。納米顆粒遞送至EpCAM-表達(dá)的、上皮癌細(xì)胞系，例如HT-29、LNCaP、以及SK-BR-3，是與來源于人類血液的大量外周血單核細(xì)胞(PBMC)懸浮液進(jìn)行比較的。
[0049]具有聚乙二醇(PEG)表面涂層的1nm氧化鐵納米顆粒被遞送至與全血混合的癌癥細(xì)胞中，并且所得到的目標(biāo)細(xì)胞混合物通過使用上文所描述的細(xì)胞分離裝置進(jìn)行處理。例如，微流體遞送系統(tǒng)被用于誘導(dǎo)細(xì)胞的快速機(jī)械變形從而生成在細(xì)胞膜中的瞬態(tài)空隙(附圖1)。所述方法已經(jīng)被證明了具有將一系列材料，包括蛋白質(zhì)、RNA、DNA以及納米顆粒遞送之多種細(xì)胞類型中的能力，并且適用于全血、通常會對微流體系統(tǒng)產(chǎn)生問題的介質(zhì)。
[0050]示例性的標(biāo)記分子，例如3kDa和70kDa，熒光標(biāo)記的、作為模型分子的葡聚糖聚合物，被用于單獨(dú)依據(jù)尺寸在PBMC與兩種不同的癌癥細(xì)胞系之間進(jìn)行區(qū)分。所述結(jié)果還表明系統(tǒng)對于磁性顆粒選擇性遞送至血液中的腫瘤細(xì)胞的功效。PEG包覆的氧化鐵顆粒被用于磁性標(biāo)記結(jié)腸癌(例如，根據(jù)細(xì)胞系HT-29所例證的)。進(jìn)一步的富集是通過將FITC共軛至氧化鐵納米顆粒表面從而直接測量納米顆粒的攝取來實(shí)現(xiàn)的。
[0051 ] PEG包覆的1nm氧化鐵納米顆粒被遞送至細(xì)胞懸浮液中，所述細(xì)胞懸浮液被懷疑含有或者已知含有CTC，例如，一種來源于患者的血液樣本，或者細(xì)胞系HT-29、LNCaP、和SK-BR-3細(xì)胞，其分別于全血進(jìn)行混合。然后對所得到的標(biāo)記細(xì)胞混合物進(jìn)行純化，例如，使用一種高保真磁分離器。所述分離器在具有高氧化鐵含量的模型CTC和效率較低標(biāo)記的PBMC之間進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。任選地，在治療、納米顆粒濃度增加、它們的尺寸改變或者涉及多個處理步驟之前，紅血細(xì)胞被裂解。
[0052]實(shí)施例3
[0053]—種基于結(jié)合的免疫學(xué)和形態(tài)學(xué)的方法如下所述實(shí)施。在基于細(xì)胞尺寸通過裝置進(jìn)行處理之后，用一種抗體或其他腫瘤細(xì)胞特異性配體例如熒光標(biāo)記的抗一 CD45抗體對細(xì)胞進(jìn)行處理。對三種不同的分離方法的敏感度和特異性進(jìn)行比較:1)僅裝置，2)僅抗一 CD45抗體，3)裝置+抗一⑶45抗體。形態(tài)標(biāo)記(裝置)+免疫標(biāo)記(例如抗一⑶45抗體)被發(fā)現(xiàn)相對于另外兩種單獨(dú)使用的技術(shù)而言可顯示出優(yōu)異的靈敏度(附圖2)。例如，能夠觀察到于單獨(dú)的抗一CD45抗體相比，其在靈敏度方面的2-5倍的增加和/或在特異性方面的2-5倍的增加。觀察到超過一個數(shù)量級的富集指數(shù)(附圖2)。
[0054]實(shí)施例4
[0055]在一個實(shí)施例中，所述裝置是由硅和玻璃制成。可替代的，所述裝置是使用一種聚合物，例如硅氧烷、PDMS、聚碳酸酯、丙烯酸、聚丙烯、聚苯乙烯制成。任何裝置都是被滅菌的(加熱或者γ輻射)并且是一次性的。針對多種細(xì)胞類型使用材料和參數(shù)對設(shè)備的性能進(jìn)行驗(yàn)證。例如，在一定范圍的流速下的用PEG包覆的量子點(diǎn)(尺寸在10-50nm范圍內(nèi))的性能被用于確定是否納米顆粒和細(xì)胞存活率的遞送效果。示例的裝置在PCT/US2012/060646中進(jìn)行描述，所述申請已經(jīng)通過引用全部并入到本文中。
[0056]優(yōu)勢
[0057]當(dāng)與現(xiàn)有的方法進(jìn)行比較時，可以發(fā)現(xiàn)該方法具有下述優(yōu)勢。相對于基于抗體的方法時，該方法提供了一種非偏離隔離過程，其適用于大多數(shù)癌癥類型中并且時獨(dú)立于任何特定的細(xì)胞表面標(biāo)記物的。所述裝置和方法實(shí)現(xiàn)了不能夠由現(xiàn)有的標(biāo)記物分離的CTC的識別，并且因此具有顯著的診斷和預(yù)后意義。
[0058]相對于現(xiàn)有的基于尺寸的分離方法，在本發(fā)明中所描述的裝置和方法提供了高很多的通量，并且是通過改變“W”(附圖1)可調(diào)的從而捕獲特定的CTC尺寸范圍。例如，一種6μπι寬的收縮部分適用于結(jié)腸癌細(xì)胞的捕獲，而一種7μι和8μπι的寬度分別適用于胰腺癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的捕獲。此外，與現(xiàn)有技術(shù)不同，這種系統(tǒng)可以與基于抗體的技術(shù)相結(jié)合用于增強(qiáng)分離敏感性和/或是CTC的子級多參數(shù)分離(例如通過分離一定尺寸+表面標(biāo)記物的CTC) ο
[0059]通過使獲自一定范圍的癌癥類型的CTC的有效的、穩(wěn)定的分離，這種技術(shù)將是對抗癌癥的一種有價值的平臺。這種技術(shù)的預(yù)后和診斷連理可以使新基因鑒別，所述新基因是癌癥發(fā)展的關(guān)鍵，并且因此使得新的治療技術(shù)的開發(fā)。它也能夠提供患者期望壽命和治療效果的更精確的預(yù)測。
[0060]在這里所描述的CTC分離方法結(jié)合了免疫學(xué)和以尺寸為基礎(chǔ)的分離，從而得到一種高富集因子/回收率以及可調(diào)的偏置(標(biāo)記特異性vs尺寸特異性)。
[0061]雖然上文只詳細(xì)描述了少數(shù)的實(shí)施例，但是其他的修改也是可能的。上文描述的實(shí)施方案可以針對公開的特征的各種組合和子組合，和/或上文描述的幾種其他特征的組合或亞組合。此外，附圖中的邏輯流程圖和/或在此的描述并不要求完全按照所示的特征順序或步驟次序來實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果。其他的實(shí)施方案可落在以下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于細(xì)胞的物理特性用于分離、鑒別、或者操作細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞包括: 提供一種細(xì)胞懸浮液； 使所述懸浮液通過一種含有收縮部分的微流體通道，所述收縮通道被調(diào)節(jié)尺寸從而將化合物遞送至具有相對不同的物理特性的細(xì)胞組中，而不是其他的細(xì)胞組； 使所述細(xì)胞懸浮溶液與一種化合物進(jìn)行接觸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述物理特性是尺寸、直徑和膜硬度的其中一種或多種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞懸浮液包括外周血細(xì)胞；以及具有不同物理特性的至少兩種不同的細(xì)胞種類中的其中一種或多種。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞懸浮液包括一種外周血細(xì)胞的紅細(xì)胞去除的群。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述較大的細(xì)胞包括循環(huán)的腫瘤細(xì)胞并且所述較小的細(xì)胞包括白細(xì)胞。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化合物包括0.5kDa至5MDa的分子質(zhì)量。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化合物包括3kDa至1MDa的分子質(zhì)量。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化合物包括可檢測的標(biāo)記物、活性分子和毒素的其中一種或多種。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述細(xì)胞通過所述收縮部分之后，可檢測的標(biāo)記物進(jìn)入到所述細(xì)胞中。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述懸浮液包括全血。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述懸浮液包括患有腫瘤風(fēng)險或者被診斷為包括腫瘤的受試者的全血。12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述腫瘤包括黑色素瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、腦癌、或者血液癌。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述收縮部分包括的寬度為4μπ?-10μπ?，長度為1μm-ΙΟΟμπι，以及串聯(lián)的1-10個收縮部分。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中細(xì)胞通過收縮部分的速度是在10mm/s至10m/s的范圍內(nèi)。15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括將壓力施用于所述細(xì)胞懸浮液用于驅(qū)使細(xì)胞通過微流體通道的收縮部分。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞懸浮液包括一種有效載荷或者其中所述方法進(jìn)一步包括在所述細(xì)胞懸浮液通過收縮部分之后將其在預(yù)定的時間內(nèi)在含有有效載荷的溶液中進(jìn)行溫育的步驟。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述有效載荷包括磁性顆粒、熒光顆粒、例如量子點(diǎn)或者碳納米管、熒光染料、熒光蛋白質(zhì)、編碼熒光蛋白質(zhì)的遺傳物質(zhì)(DNA或者RNA)、其他能夠檢測的化合物(例如，熒光素酶)、影響細(xì)胞功能的化合物以及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的化合物的一種或多種。18.—種用于從非腫瘤細(xì)胞中區(qū)分腫瘤細(xì)胞的微流體通道，包括: 一種定義了內(nèi)腔的微流體通道，并且被配置從而使懸浮在緩沖液中的腫瘤細(xì)胞能夠經(jīng)此通過，并且與非腫瘤細(xì)胞相比對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行收縮，其中所述微流體通道包括細(xì)胞變形的收縮部分，其中所述收縮部分的直徑是細(xì)胞直徑的函數(shù)。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的系統(tǒng)，其中所述收縮通道被調(diào)整尺寸從而與非腫瘤細(xì)胞相比優(yōu)先使腫瘤細(xì)胞變形。
【文檔編號】B07B1/00GK105848793SQ201480056295
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年8月15日
【發(fā)明人】A·R·沙瑞, V·A·阿達(dá)爾斯泰因松, N·曹, R·S·蘭格, J·C·洛夫, K·F·延森
【申請人】麻省理工學(xué)院