一種從發(fā)酵液中提取環(huán)磷酸腺苷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵產(chǎn)物提取技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種從發(fā)酵液中提取環(huán)磷酸腺苷的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)磷酸腺苷即腺嘌呤核苷3’，5’-環(huán)磷酸酯，簡稱cAMP，它是一種人體內(nèi)廣泛存在的、具有重要生理活性的物質(zhì)，在人體中環(huán)磷腺苷可由三環(huán)磷腺苷經(jīng)腺苷活化酶催化生成。作為參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的第二信使物質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮激素調(diào)節(jié)生理機(jī)能和物質(zhì)代謝的作用，對糖、脂肪代謝、核酸蛋白質(zhì)的合成、調(diào)節(jié)等起著重要作用。能使心肌收縮力增強(qiáng)，引起血壓升高，心輸出量增高。并能舒張平滑肌、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、改善肝功能、促進(jìn)神經(jīng)再生、抑制皮膚外層上皮細(xì)胞分裂及轉(zhuǎn)化異常細(xì)胞的功能、促進(jìn)呼吸鏈氧化酶的活性及改善心肌缺氧等。近年來，環(huán)磷酸腺苷成為許多疾病，如心血管疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和老年癡呆癥的治療目標(biāo)。
[0003]目前，環(huán)磷酸腺苷的主要生產(chǎn)方法是化學(xué)合成法，存在工藝復(fù)雜，原料昂貴且不易獲得，副產(chǎn)物多，收率低，成本高，產(chǎn)量小，會導(dǎo)致污染環(huán)境，以及不利于工業(yè)化生產(chǎn)等缺點(diǎn)。
[0004]利用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷，成本低、廢水易于處理，有利于環(huán)境保護(hù)，現(xiàn)有微生物生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷技術(shù)主要是采用離子交換和樹脂層析工藝，成本高，用水量大，采用甲酸洗脫，再經(jīng)NH4OH中和，直接排放既浪費(fèi)又造成環(huán)境污染，采用薄層色譜純化cAMP，需要將硅膠板上cAMP區(qū)帶刮下后再行分離出cAMP，不但操作繁瑣，而且不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種從發(fā)酵液中提取環(huán)磷酸腺苷的方法，該方法從發(fā)酵液中提取的環(huán)磷酸腺苷純度高、適合工業(yè)化生產(chǎn)，且生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)成本低、廢水易于處理，有利于環(huán)境保護(hù)。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的，一種從發(fā)酵液中提取環(huán)磷酸腺苷的方法，所述發(fā)酵液為節(jié)桿菌發(fā)酵液，包括以下操作步驟:
O除菌體:將發(fā)酵液加熱至60— 80°C，過陶瓷膜，收集超濾液；
2)上柱:將獲得的超濾液加氨水調(diào)節(jié)pH至7.05—7.95，過炭層析柱；
3)解析:用氨水進(jìn)行洗脫解析，得到洗脫液；
4)濃縮:將步驟3)獲得的洗脫液加氨水調(diào)節(jié)pH至7.05—7.95，進(jìn)行真空濃縮，收集濃縮液；
5)抽濾:將步驟4)所收集的濃縮液，經(jīng)真空抽濾去除次黃嘌呤，收集濾液；
6)結(jié)晶:將步驟5)獲得的濾液pH調(diào)節(jié)至2-3，然后流加1-3倍所述濾液體積的甲醇進(jìn)行結(jié)晶，抽濾后得環(huán)磷酸腺苷粗品；
7)重結(jié)晶:將步驟6)所獲得的環(huán)磷酸腺苷粗品用純化水溶解后，流加1-3倍所述濾液體積的甲醇進(jìn)行結(jié)晶，抽濾真空干燥后得環(huán)磷酸腺苷成品。
[0007]本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案還具有以下特征:
所述陶瓷膜的孔徑為0.02-0.05 μ mo
[0008]所述炭層析柱使用的活性炭為果殼型活性炭。
[0009]步驟4)所述濃縮為減壓濃縮，真空度為0.0750.1MPa，濃縮溫度為60_70°C，將洗脫液體積濃縮至洗脫液初始體積的1/5 — 1/8，濃縮液效價(jià)在20-30g/L。
[0010]所述純化水為二級反滲透水，電導(dǎo)率< 2.0 μ S/cm。
[0011]步驟7)所述真空干燥，真空度為0.0750.1MPa，干燥溫度為45—65°C，干燥時(shí)間 8—1h0
[0012]本發(fā)明的有益效果:1、本發(fā)明采用炭層析方法，取代傳統(tǒng)的離子交換和樹脂層析工藝，降低了生產(chǎn)成本；2、陶瓷膜過濾，除菌體效果好，產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定，收率最高可達(dá)75%，純度不低于97.5% ;3、本工藝采用氨水洗脫，利于廢水處理，有利于環(huán)境保護(hù)。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0014]實(shí)施例1 發(fā)酵液的制備
本發(fā)明所用發(fā)酵液為節(jié)桿菌發(fā)酵液，其中菌種編號為CAMP091015，為本公司菌種室保藏。
[0015]本實(shí)施例所用培養(yǎng)基具體組成如下:
斜面培養(yǎng)基(g/100ml):土豆汁10，蛋白胨1.0，硫酸鎂0.001，鳥嘌呤0.05，瓊脂2.0，pH7.0o
[0016]種子培養(yǎng)基(g/100ml):葡萄糖1.0，酵母膏1.0，蛋白胨1.0，牛肉膏1.0，尿素0.6，氯化鈉 0.2，pH7.0。
[0017]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/100ml):葡萄糖4.5，磷酸氫二鉀1.0，磷酸二氫鉀1.0，硫酸鎂0.5，生物素0.005，氯化鈷0.001，次黃嘌呤0.006等，ρΗ7.0。
[0018]發(fā)酵條件如下:
將在1_4°C冰箱保存菌種接種于斜面培養(yǎng)基活化，30°C培養(yǎng)24h。斜面培養(yǎng)基上的菌苔接種于種子培養(yǎng)基，30°C、220rpm培養(yǎng)16h ;將培養(yǎng)好的種子以10%的接種量接種于發(fā)酵罐。
[0019]實(shí)施例2
本實(shí)施例提供一種從發(fā)酵液中提取環(huán)磷腺苷的方法，操作步驟如下:
1.采用本實(shí)施例1所制備的發(fā)酵液1L，發(fā)酵液單位4g/L，將發(fā)酵液加熱到70°C后過孔徑為0.02—0.05 ym的陶瓷膜，獲得超濾液；
2.收集步驟I所制備的超濾液，用氨水調(diào)節(jié)pH至7.05，過炭層析柱吸附后加氨水進(jìn)行洗脫解析，獲得洗脫液，所述炭層析柱使用的活性炭為果殼型活性炭；
3.將步驟2所得洗脫液用氨水調(diào)節(jié)pH至7.05，在真空度0.075-0.1Mpa,濃縮溫度50-60°C的條件下濃縮至初始體積的五分之一，向濃縮液加入濃縮液體積1%的針劑活性炭，在60°C脫色處理15min，抽濾后獲得第一脫色液；
4.向步驟3所得第一脫色液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，以流加的方式加入等體積的甲醇進(jìn)行結(jié)晶，抽濾后的環(huán)磷腺苷粗品；
5.步驟4所得粗品加入3倍體積的純化水溶解后，再加入粗品重量2%的針劑活性炭，在60°C脫色處理15min，抽濾后得第二脫色液，所述純化水為二級反滲透水，電導(dǎo)率
<2.0 μ S/cm ；
6.將步驟5所得濾液的體積濃縮至原體積的五分之一，再加入等體積的甲醇結(jié)晶，真空干燥得環(huán)磷腺苷成品，收率為72%，純度為97.5%。
[0020]實(shí)施例3
本實(shí)施例提供了一種從發(fā)酵液中提取環(huán)磷腺苷的方法，操作步驟如下:
1.采用本實(shí)施例1所制備的發(fā)酵液1L，發(fā)酵液單位4g/L，將發(fā)酵液加熱到70°C后過孔徑為0.02—0.05 ym的陶瓷膜，獲得超濾液；
2.收集步驟I所制備的超濾液，用氨水調(diào)節(jié)pH至7.5，過炭層析柱吸附后加氨水進(jìn)行洗脫解析獲得洗脫液，所述炭層析柱使用的活性炭為果殼型活性炭；
3.將步驟2所得洗脫液用氨水調(diào)節(jié)pH至7.5，在真空度0.075-0.1Mpa,濃縮溫度50-60°C的條件下濃縮至初始體積的六分之一，向濃縮液加入濃縮液體積1%的針劑活性炭，在60°C脫色處理15min，抽濾后獲得第一脫色液；
4.向步驟3所得第一脫色液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.5，以流加的方式加入2倍體積的甲醇進(jìn)行結(jié)晶，抽濾后的環(huán)磷腺苷粗品；
5.步驟4所得粗品加入3倍體積的純化水溶解后，再加入粗品重量2%的針劑活性炭，在60°C脫色處理15min，抽濾后得第二脫色液，所述純化水為二級反滲透水，電導(dǎo)率
<2.0 μ S/cm ；
6.將步驟5所得濾液的體積濃縮至原體積的六分之一，再加入2倍體積的甲醇結(jié)晶，真空干燥得環(huán)磷腺苷成品，收率為75%，純度為99%。
[0021]實(shí)施例4
本實(shí)施例提供了一種從發(fā)酵液中提取環(huán)磷腺苷的方法，操作步驟如下:
1.采用本實(shí)施例1所制備的發(fā)酵液1L，發(fā)酵液單位4g/L，將發(fā)酵液加熱到70°C后過孔徑為0.02—0.05 ym的陶瓷膜，獲得超濾液；
2.收集步驟I所制備的超濾液，用氨水調(diào)節(jié)pH至7.95，過炭層析柱吸附后加氨水進(jìn)行洗脫解析獲得洗脫液，所述炭層析柱使用的活性炭為果殼型活性炭；
3.將步驟2所得洗脫液用氨水調(diào)節(jié)pH至7.95，在真空度0.075-0.1Mpa,濃縮溫度50-60°C的條件下濃縮至初始體積的八分之一，向濃縮液加入濃縮液體積1%的針劑活性炭，在60°C脫色處理15min，抽濾后獲得第一脫色液；
4.向步驟3所得第一脫色液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.5，以流加的方式加入3倍體積的甲醇進(jìn)行結(jié)晶，抽濾后的環(huán)磷腺苷粗品；
5.步驟4所得粗品加入3倍體積的純化水溶解后，再加入粗品重量2%的針劑活性炭，在60°C脫色處理15min，抽濾后得第二脫色液，所述純化水為二級反滲透水，電導(dǎo)率
<2.0 μ S/cm ；
6.將步驟5所得濾液的體積濃縮至原體積的八分之一，再加入3倍體積的甲醇結(jié)晶，真空干燥得環(huán)磷腺苷成品，收率為73%，純度為98%。
[0022]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制；任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種從發(fā)酵液中提取環(huán)磷酸腺苷的方法，所述發(fā)酵液為節(jié)桿菌發(fā)酵液，其特征在于，包括以下操作步驟: 1)除菌體:將發(fā)酵液加熱至60—80°C，過陶瓷膜，收集超濾液； 2)上柱:將獲得的超濾液加氨水調(diào)節(jié)pH至7.05—7.95，過炭層析柱； 3)解析:用氨水進(jìn)行洗脫解析，得到洗脫液； 4)濃縮:將步驟3)獲得的洗脫液加氨水調(diào)節(jié)pH至7.05—7.95，進(jìn)行真空濃縮，收集濃縮液； 5)抽濾:將步驟4)所收集的濃縮液，經(jīng)真空抽濾去除次黃嘌呤，收集濾液； 6)結(jié)晶:將步驟5)獲得的濾液pH調(diào)節(jié)至2-3，然后流加1-3倍所述濾液體積的甲醇進(jìn)行結(jié)晶，抽濾后得環(huán)磷酸腺苷粗品； 7)重結(jié)晶:將步驟6)所獲得的環(huán)磷酸腺苷粗品用純化水溶解后，流加1-3倍所述濾液體積的甲醇進(jìn)行結(jié)晶，抽濾真空干燥后得環(huán)磷酸腺苷成品。
2.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述陶瓷膜的孔徑為0.02-0.05 μ mo
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述炭層析柱使用的活性炭為果殼型活性炭。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟4)所述濃縮為減壓濃縮，真空度為.0.0750.1MPa，濃縮溫度為60-70°C，將洗脫液體積濃縮至洗脫液初始體積的1/5 —1/8，濃縮液效價(jià)在20-30g/L。
5.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述純化水為二級反滲透水，電導(dǎo)率< 2.0 μ S/cm。
6.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟7)所述真空干燥，真空度為.0.0750.1MPa，干燥溫度為 45—65°C，干燥時(shí)間 8—10h。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種從發(fā)酵液中提取環(huán)磷酸腺苷的方法，屬于生物活性物質(zhì)提取技術(shù)領(lǐng)域，將發(fā)酵液加熱經(jīng)膜過濾后獲得超濾液，將超濾液pH調(diào)節(jié)成堿性過炭層析柱吸附，用氨水洗脫，收集洗脫液，將洗脫液調(diào)節(jié)pH至堿性后，55-60℃抽真空濃縮、抽濾，將濾液pH調(diào)節(jié)至酸性后流加甲醇結(jié)晶，晶體真空干燥后得環(huán)磷酸腺苷粗品，將粗品用甲醇重結(jié)晶得環(huán)磷腺苷成品。本發(fā)明所制備的環(huán)磷酸腺苷品質(zhì)穩(wěn)定，純度最高可達(dá)99%，收率最高可達(dá)75%，采用炭層析方法取代傳統(tǒng)的離子交換和樹脂層析工藝，降低了生產(chǎn)成本，氨水洗脫利于廢水處理。
【IPC分類】C07H19-213, C07H1-06
【公開號】CN104788522
【申請?zhí)枴緾N201510134004
【發(fā)明人】任啟偉, 秦艷飛, 蔡慧麗, 李為全, 劉瑞華, 孟詠梅, 張淑珍
【申請人】安徽省皖北藥業(yè)股份有限公司
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年3月26日