同時制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及茶多酚中兒茶素的分離純化方法，尤其是涉及一種利用大孔吸附樹脂 結(jié)合瓊脂凝膠微球鍵合e-CD介質(zhì)從茶多酚中同時制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸 酯和表兒茶素沒食子酸酯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 茶多酚是茶葉中主要的活性之一，其成分主要是兒茶素類物質(zhì)，約占60%? 80%，而其中EGCG含量最高，約占兒茶素的50%?60%，ECG其次，約占10%?20%。EGCG 具備抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、修復(fù)電離輻射造成的皮膚損傷、降血脂、降血糖、抗癌、 抑制心血管疾病等眾多生活活性特征，引起國內(nèi)外學者的廣泛興趣，而研宄表明，ECG也具 備眾多生物活性，如抗菌、抗癌、抑制動脈硬化、調(diào)節(jié)心律等。
[0003] 目前制備EGCG和ECG方法有化學合成和天然產(chǎn)物提取，而化學合成的步驟繁瑣， 產(chǎn)率低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)；在天然產(chǎn)物提取方面，主要有沉淀法、溶劑萃取法以及柱色譜 等方法，沉淀法帶來的金屬離子殘留和溶劑萃取法中的有機溶劑殘留等問題，難以達到保 健食品和醫(yī)藥質(zhì)量標準，因此柱色譜方法比較普遍，其報道的方法，如大孔吸附樹脂、硅膠、 聚酰胺、C-18反相柱、Sephadex LH-20等柱層析方法，但目前存在的缺陷在于單憑某一種方 法難以制備較高純度，或高純度條件下產(chǎn)物回收率低。如中國專利CN102702163 B中得到 茶多酚精品后，通過離子絡(luò)合沉淀，過濾，酸轉(zhuǎn)溶，大孔樹脂吸附得到兒茶素，然后兒茶素經(jīng) 過兩次大孔吸附樹脂純化，得到純度98%以上的EGCG單步收率50 %左右，工藝流程非常繁 瑣；中國專利CN101643466 B中茶多酚經(jīng)過乙酸乙酯萃取兩次，合并有機相后濃縮得到浸 膏，浸膏水溶解液先后通過聚酰胺和大孔吸附樹脂吸附解析，解析液在此濃縮得到浸膏，高 濃度純水溶解后，加晶種結(jié)晶24h，其步驟繁瑣，收率也僅約為30%。中國專利CN 1199965 C中用S印hadex LH-20 -步純化，其整個過程柱色譜參數(shù)難以放大；專利CN1193994C中用 丙酮、氯仿等溶劑在氮氣保護下反復(fù)結(jié)晶后通過Sephadex LH-20純化，步驟繁瑣，難以連貫 進行放大生產(chǎn)。專利CN101921253B中用膜技術(shù)得到高純度的EGCG，但整個過程也需要借助 萃取，樹脂層析，高濃度結(jié)晶。CN 102276570 B中C-18鍵合硅膠反相柱得到高純度EGCG， 但也需要借助SMB色譜技術(shù)，其雖然能夠工藝流程連貫，但成本高。CN102964329B中也是通 過高聚合物反相柱層析得到高純度EGCG，但是反相填料較為昂貴，投入成本較高。徐軍等利 用寡聚環(huán)糊精配基鍵合介質(zhì)分離EGCG(利用寡聚環(huán)糊精配基鍵合介質(zhì)分離表沒食子兒茶 素沒食子酸酯的新方法，化工進展，2005(24)，1171-1175)，其介質(zhì)用瓊脂糖作為材料基質(zhì)， 成本較高，而且負載量較小。
[0004] 由于EGCG和ECG化學性質(zhì)較為相似，茶多酚精制幾乎都是以EGCG為目標產(chǎn)物，而 將ECG作為雜質(zhì)予以去除，這樣造成資源浪費。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的旨在提供一種回收率高、整個工藝過程成本低、污染小的同時制備 高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯的方法。
[0006] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0007] 1)用水溶解茶多酚，過濾后，得到澄清的茶多酚水溶液；
[0008] 2)利用弱極性大孔吸附樹脂對步驟1)得到的茶多酚水溶液進行吸附，再通過梯 度洗脫，分別得到富含EGCG餾分、EGCG與ECG重疊餾分、富含ECG餾分；
[0009] 3)將步驟2)得到的富含EGCG餾分通過瓊脂凝膠微球鍵合e -⑶（簡稱AG- e -⑶） 介質(zhì)進行柱層析，以80%乙醇為流動相進行洗脫，EGCG純度高于95%時，收率高于85% ;
[0010] 4)將步驟2)得到的EGCG與ECG重疊餾分，通過純化水稀釋，然后進行酒精計檢 測，將醇濃度控制在< 10 %，重復(fù)步驟2);
[0011] 5)將步驟2)得到的富含ECG餾分通過瓊脂凝膠微球鍵合e -⑶（簡稱AG- e -⑶） 介質(zhì)進行柱層析，以80%乙醇為流動相進行洗脫，ECG純度高于90%時，收率高于80% ;
[0012] 6)將步驟3)和5)所得產(chǎn)物分別減壓濃縮除醇后，進行冷凍干燥，分別得到高純度 表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯。
[0013] 在步驟1)中，所述水可采用純化水；所述茶多酚水溶液中按質(zhì)量百分比 EGCG 彡 30%，ECG 彡 10%。
[0014] 在步驟2)中，所述弱極性大孔吸附樹脂可采用HPD450樹脂、AB-8樹脂、D180樹 脂等中的一種，優(yōu)選AB-8樹脂；所述通過梯度洗脫可通過10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、 40 %乙醇和50 %乙醇梯度洗脫，每個梯度流動相洗脫體積可控制在1?3BV，洗脫流速可 為0. 8?2. OBV/h ;優(yōu)選每個梯度流動相洗脫體積為2BV，洗脫流速為1. 5BV/h ;流動相為乙 醇-水二元流動相。
[0015] 在步驟3)中，所述柱層析的上柱原液與樹脂之間的承載量可為30?40g/L，優(yōu)選 35g/L，其中，上柱原液以茶多酚含量計算，樹脂以柱體積計算；所述柱層析的上柱原液的相 關(guān)物質(zhì)的色譜純度要求為EGCG彡40 %，ECG < 1 %，純化介質(zhì)的承載量可為5?7g/L，優(yōu)選 6g/L，其中EGCG含量以質(zhì)量計算，柱體積以體積計算；所述洗脫的流速可為2?3BV/h，優(yōu) 選2. 5BV/h ;動相為乙醇-水二元流動相；所述瓊脂凝膠微球鍵合0 -⑶(AG- 0 -⑶）介質(zhì)的 形狀為圓球形，顆粒直徑為50?200 ym，微球骨架為10%交聯(lián)瓊脂，功能基團為0 -⑶。
[0016] 在步驟4)中，所述EGCG與ECG重疊餾分，可循環(huán)通過AB-8樹脂分離。
[0017] 在步驟5)中，所述柱層析的上柱原液的相關(guān)物質(zhì)控制范圍可為ECG多40%， EGCGS 1%。純化介質(zhì)的承載量可為3?5g/L，優(yōu)選4g/L，其中，ECG含量以質(zhì)量計算，柱 體積以體積計算；所述洗脫的流速可為2?3BV/h，優(yōu)選2. 5BV/h，流動相為乙醇-水二元 流動相；所述瓊脂凝膠微球鍵合0 -CD (AG-f3 -CD)介質(zhì)的形狀為圓球形，顆粒直徑為50? 200 ym，微球骨架為10 %交聯(lián)瓊脂，功能基團為⑶。
[0018] 所制備的高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯可采用以下 方法進行色譜檢測：
[0019]采用沃特世e296高效液相色譜系統(tǒng)，2998PDA紫外檢測器，沃特世色譜柱， 250mmX 4. 6mm，填料為RP-C18硅膠柱，色譜柱溫度為35°C，檢測波長280nm，標準品為含量 98% EGCG和98% ECG (sigma公司），流動相A為甲醇，流動相B為0. 075 %冰醋酸水溶液， 洗脫方式為梯度洗脫，結(jié)果參見表1。
[0020]表 1
【主權(quán)項】
1. 同時制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯的方法，其特征 在于包括以下步驟： 1) 用水溶解茶多酚，過濾后，得到澄清的茶多酚水溶液； 2) 利用弱極性大孔吸附樹脂對步驟1)得到的茶多酚水溶液進行吸附，再通過梯度洗 脫，分別得到富含EGCG餾分、EGCG與ECG重疊餾分、富含ECG餾分； 3) 將步驟2)得到的富含EGCG餾分通過瓊脂凝膠微球鍵合β-CD介質(zhì)進行柱層析，以 80%乙醇為流動相進行洗脫，EGCG純度高于95%時，收率高于85% ; 4) 將步驟2)得到的EGCG與ECG重疊餾分，通過純化水稀釋，然后進行酒精計檢測，將 醇濃度控制在< 10%，重復(fù)步驟2); 5) 將步驟2)得到的富含ECG餾分通過瓊脂凝膠微球鍵合β -CD介質(zhì)進行柱層析，以 80%乙醇為流動相進行洗脫，ECG純度高于90%時，收率高于80% ; 6) 將步驟3)和5)所得產(chǎn)物分別減壓濃縮除醇后，進行冷凍干燥，分別得到高純度表沒 食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯。
2. 如權(quán)利要求1所述同時制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子 酸酯的方法，其特征在于在步驟1)中，所述水采用純化水；所述茶多酚水溶液中按質(zhì)量百 分比 EGCG 彡 30%，ECG 彡 10%。
3. 如權(quán)利要求1所述同時制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子 酸酯的方法，其特征在于在步驟2)中，所述弱極性大孔吸附樹脂采用HPD450樹脂、AB-8樹 月旨、D180樹脂中的一種，優(yōu)選AB-8樹脂。
4. 如權(quán)利要求1所述同時制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子 酸酯的方法，其特征在于在步驟2)中，所述通過梯度洗脫是通過10%乙醇、20%乙醇、30% 乙醇、40 %乙醇和50 %乙醇梯度洗脫，每個梯度流動相洗脫體積控制在1?3BV，洗脫流速 為0. 8?2. OBV/h ;優(yōu)選每個梯度流動相洗脫體積為2BV，洗脫流速為I. 5BV/h ;流動相為乙 醇-水二元流動相。
5. 如權(quán)利要求1所述同時制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子 酸酯的方法，其特征在于在步驟3)中，所述柱層析的上柱原液與樹脂之間的承載量為30? 40g/L，優(yōu)選35g/L，其中，上柱原液以茶多酚含量計算，樹脂以柱體積計算。
6. 如權(quán)利要求1所述同時制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子 酸酯的方法，其特征在于在步驟3)中，所述柱層析的上柱原液的相關(guān)物質(zhì)的色譜純度要求 為EGCG彡40 %，ECG < 1 %，純化介質(zhì)的承載量為5?7g/L，優(yōu)選6g/L，其中EGCG含量以 質(zhì)量計算，柱體積以體積計算；所述洗脫的流速可為2?3BV/h，優(yōu)選2. 5BV/h ;流動相為乙 醇-水二元流動相。
7. 如權(quán)利要求1所述同時制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子 酸酯的方法，其特征在于在步驟4)中，所述EGCG與ECG重疊餾分的循環(huán)通過AB-8樹脂分 離。
8. 如權(quán)利要求1所述同時制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食 子酸酯的方法，其特征在于在步驟5)中，所述柱層析的上柱原液的相關(guān)物質(zhì)控制范圍為 ECG彡40%，EGCG < 1 % ;純化介質(zhì)的承載量為3?5g/L，優(yōu)選4g/L，其中，ECG含量以質(zhì)量 計算，柱體積以體積計算。
9. 如權(quán)利要求1所述同時制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子 酸酯的方法，其特征在于在步驟5)中，所述洗脫的流速為2?3BV/h，優(yōu)選2. 5BV/h，流動相 為乙醇-水二元流動相。
10. 如權(quán)利要求1所述同時制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子 酸酯的方法，其特征在于在步驟3)和5)中，所述瓊脂凝膠微球鍵合β-CD介質(zhì)的形狀為圓 球形，顆粒直徑為50?200 μ m，微球骨架為10%交聯(lián)瓊脂，功能基團為β -⑶。
【專利摘要】同時制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯的方法，涉及茶多酚中兒茶素的分離純化方法。將茶多酚溶液通過弱極性大孔吸附樹脂，乙醇-水二元梯度洗脫，得到富含EGCG餾分、EGCG與ECG重疊餾分、富含ECG餾分；富含EGCG餾分通過AG-β-CD介質(zhì)柱層析，純度95％以上的EGCG時回收率高于85％；富含ECG餾分同樣用AG-β-CD柱層析，ECG純度達到90％以上時的回收率為高于80％；EGCG與ECG重疊餾分循環(huán)通過同型號的大孔吸附樹脂處理，繼續(xù)分離富含EGCG餾分和富含ECG餾分?；厥章矢摺a(chǎn)率高、分離介質(zhì)價格低、無有毒溶劑、工藝簡單。
【IPC分類】C07D311-62
【公開號】CN104592190
【申請?zhí)枴緾N201510083824
【發(fā)明人】石國宗, 呂述權(quán), 趙坐都, 陳靜, 張慧蘭
【申請人】廈門藍灣科技有限公司
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年2月16日