一種檢測傳染性脾腎壞死病毒的抗體及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物免疫技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測傳染性脾腎壞死病毒的抗 體及其制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 傳染性脾腎壞死病毒（InfectiousSpleenandKidneyNecrosisVirus，ISKNV) 是虹彩病毒科（Iridoviridae)腫大細胞病毒屬（Megalocytivirus)的代表種，是一類具有 正二十面體的胞漿型大型雙鏈DNA病毒，基因組由111，362個堿基組成，包括125個預(yù)測開 放讀碼框ORF(openreadingframes)。ISKNV可以感染近60種淡水和海水魚，是鱖、加洲 鱸和美國紅魚養(yǎng)殖業(yè)的巨大威脅，鱖魚是其主要感染宿。
[0003] 鱖（Sinipercachuatsi)是隹盧形目真隹盧科鱖屬的魚類，俗稱鱖魚、花鯽魚、桂魚、季 花魚等，是中國特產(chǎn)的一種食用淡水魚，也是我國重要的淡水魚特色養(yǎng)殖品種之一；由傳染 性脾腎壞死病毒（Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)引起的繼魚虹 彩病毒病是鱖魚養(yǎng)殖的主要疫病，導(dǎo)致頓死亡率接近100%，成為制約鱖養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要 瓶頸。自1994年以來，ISKNV引起了廣東省的鱖養(yǎng)殖重大經(jīng)濟損失，其傳染力強，發(fā)病率高 達30 %，致死率高達90 %以上，平均每年經(jīng)濟損失高達2億元。對ISKNV的感染進行檢測， 是防止該病毒病暴發(fā)的必要手段。目前國內(nèi)外針對該病毒的診斷方法局限于聚合酶鏈式反 應(yīng)（PCR)技術(shù)，尚未有其它診斷方法的報道，PCR檢測法需要提純病魚組織DNA，且假陽性率 較高，限制了該方法的推廣和使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測傳染性脾腎壞死病毒 抗體，以多肽為抗原獲得特異性的傳染性脾腎壞死病毒抗體，該多肽序列與虹彩病毒屬其 它種病毒的同源性較低，無連續(xù)5個以上氨基酸相一致，該抗體用于檢測傳染性脾腎壞死 病毒，具有特異性。
[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種檢測傳染性脾腎壞死病毒的抗體，其為兔抗ISKNV-23P8多克隆抗體，是以含 有序列號為SEQIDNO:1的一段氨基酸殘基為表位抗原，獲得特異性識別ISKNV-23P8的多 克隆抗體。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種檢測傳染性脾腎壞死病毒的抗體的制備方法，通過該方法獲 得一種特異性識別ISKNV的多克隆抗體，用于熒光免疫檢測傳染性脾腎壞死病毒。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明中所述的制備方法的具體方案如下。
[0009] -種檢測傳染性脾腎壞死病毒的抗體的制備方法，利用Antigenic和DNAstar/ protean抗原決定簇分析軟件對傳染性脾腎壞死病毒毒株編碼的膜蛋白VP23R的氨基酸 序列進行分析，篩選出一段14個氨基酸殘基抗原表位的多肽片段，并以該多肽片段制備抗 VP23R蛋白的兔抗ISKNV-23P8多克隆抗體；所述多肽片段的序列為SEQIDNO:1。
[0010] 具體地，所述的制備方法包括以下步驟：
[0011] 1)合成多肽：以上述多肽片段為模板，用生物學方法合成多肽，用HPLC對合成的 多肽進行純化，純度在85%以上；
[0012] 2)耦聯(lián)：將上述步驟1)合成多肽耦聯(lián)至鑰孔血藍蛋白（KLH)中，獲得23P8-KLH復(fù) 合物；
[0013] 3)乳化：用弗氏完全佐劑對上述步驟2)得到的23P8-KLH復(fù)合物進行乳化；
[0014] 4)免疫：用上述步驟3)的乳劑免疫新西蘭大白兔，背部皮下多點注射，首免后 10-15天，用弗氏不完全佐劑乳化的23P8-KLH進行一次加強免疫；
[0015] 5)血清抗體的檢驗與制備：加強免疫后7天，用Western-blotting檢測兔血清中 特異抗體的生成情況；
[0016] 6)親和層析：利用ISKNV-23P8耦聯(lián)的瓊脂糖凝膠對血清中特異抗體進行親和層 析，獲得兔抗ISKNV-23P8多克隆抗體。
[0017] 進一步地，步驟5)的具體方法為：以ISKNV感染48小時后的MFF-I細胞培養(yǎng)上清 為樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，用10%脫脂奶粉封閉硝酸纖維素 膜，37°C，Ih;然后分別加入1:4000倍稀釋的兔血清，4°C，過夜后，用TBST清洗3次硝酸纖 維素膜；然后加入2000倍稀釋的HRP-羊抗兔IgG二抗，37°C，lh，用TBST清洗3次硝酸纖 維素膜，用DAB顯色試劑進行顯色；待分子量為200KDa的蛋白顯色則判定為ISKNV-23P8血 清抗體陽性；通過耳部靜脈血管采集兔子血液，室溫下放置1小時后，4°C，過夜，3000rpm離 心5分鐘，收集血清。
[0018] -種檢測傳染性脾腎壞死病毒的免疫熒光檢測試劑盒，其包含本發(fā)明所述的檢測 傳染性脾腎壞死病毒的抗體。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種傳染性脾腎壞死病毒感染非診斷性的印片免疫熒光快速檢 測方法，該方法具有特異性好、操作簡單、快速、靈敏的特點，較PCR方法有明顯優(yōu)勢，全部 操作可在1. 5小時內(nèi)完成，可用于各種易感魚類養(yǎng)殖過程中的ISKNV感染檢測。
[0020] 一種傳染性脾腎壞死病毒感染非診斷性的印片免疫熒光快速檢測方法，包括以下 步驟：
[0021] 1)疑似染病組織處理：取疑似ISKNV感染的病魚脾臟組織，以刀片切開脾臟，在載 玻片上印片；
[0022] 2)固定：以4%多聚甲醛溶液覆蓋上述載玻片，室溫固定3-10min;
[0023] 3)封閉：經(jīng)步驟2)固定后的載玻片用含有1%牛血清白蛋白的PBST溶液于室溫 封閉 10-20min;
[0024] 4)抗體撫育：經(jīng)步驟3)處理后的載玻片加入用PBST以體積比為I:1000-3000比 例稀釋的本發(fā)明所述的檢測傳染性脾腎壞死病毒的抗體（即特異性識別ISKNV-23P8的多 克隆抗體），室溫撫育30-50min，再以PBST充分洗滌；
[0025] 5)熒光標記：上述步驟4)處理后的載玻片加入熒光標記的羊抗兔IgG二抗，撫育 20-40min，再用PBST洗滌；
[0026] 7)檢測焚光信號：載玻片經(jīng)焚光標記后，用蓋玻片封片，免疫焚光顯微鏡鏡檢測， 檢測焚光信號。
[0027] 具體地，步驟1)所使用的載玻片經(jīng)硅化或經(jīng)多聚賴氨酸處理。
[0028] 具體地，步驟1)以新鮮脾臟的剖切面在載玻片上進行印片。
[0029] 具體地，步驟5)中，所述羊抗兔IgG二抗采用FITC熒光標記。
[0030] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0031] 1.本發(fā)明所述的檢測傳染性脾腎壞死病毒抗體可特異性識別ISKNVVP23R的條 帶，與不含有VP23R的蛋白之間無交叉反應(yīng)；
[0032] 2.本發(fā)明所述的檢測傳染性脾腎壞死病毒的免疫熒光檢測試劑盒利用特異性識 別ISKNV編碼的特有細胞膜定位蛋白VP23R的多克隆抗體，對病魚組織中病毒感染細胞進 行免疫熒光檢測，具有特異性好、操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點；
[0033] 3.本發(fā)明所述的傳染性脾腎壞死病毒感染非診斷性的印片免疫熒光快速檢測方 法具有特異性好、操作簡單、快速、靈敏的特點，較PCR方法有明顯優(yōu)勢，全部操作可在1. 5 小時內(nèi)完成，可用于各種易感魚類養(yǎng)殖過程中的ISKNV感染檢測。
[0034] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0035] 圖1為鱖脾臟組織切片的免疫熒光圖；其中，A、B為感染ISKNV的鱖脾臟組織切 片，其中B為激發(fā)光下的熒光細胞，可見本發(fā)明的兔抗ISKNV-23P8多克隆抗體可特異性識 別ISKNV感染的脾臟組織細胞；C、D為健康鱖脾臟組織切片，其中D為激發(fā)光下的組織細 胞，未感染IKSNV的健康魚脾臟組織無熒光信號；
[0036] 圖2為ISKNV感染發(fā)病的鱖魚脾臟組織印片免疫熒光檢測結(jié)果圖；其中A圖為激 發(fā)光下的熒光圖，B圖為白光下圖片；
[0037] 圖3健康鱖魚脾臟組織印片免疫熒光檢測結(jié)果圖，A為激發(fā)光下的熒光圖，B為白 光下圖片；
[0038] 圖4為鱖脾臟組織樣品Western-blotting結(jié)果圖；泳道1::感染ISKNV的鱖脾臟 組織；泳道2:健康鱖脾臟組織；
[0039] 圖5為，其中a圖為激發(fā)光下的熒光圖，b圖為白光下圖片
[0040] 圖6為，其中a圖為激發(fā)光下的焚光圖，b圖為白光下圖片。
【具體實施方式】
[0041] 一種檢測傳染性脾腎壞死病毒的抗體，其為兔抗ISKNV-23P8多克隆抗體，是以含 有序列號為SEQIDNO:1的一段氨基酸殘基為表位抗原，獲得特異性識別ISKNV-23P8的多 克隆抗體。
[0042] -種檢測傳染性脾腎壞死病毒的抗體的制備方法，利用Antigenic和DNAstar/ protean抗原決定簇分析軟件對傳染性脾腎壞死病毒毒株編碼的膜蛋白VP23R的氨基酸 序列進行分析，篩選出一段14個氨基酸殘基抗原表位的多肽片段，并以該多肽片段制備抗 VP23R蛋白的兔抗ISKNV-23P8多克隆抗體；所述多肽片段的序列為SEQIDNO:1。
[0043] 以下是本發(fā)明具體的實施例，在下述實施例中所涉及的
[0044] 實施例1
[0045] -種檢