專(zhuān)利名稱(chēng)：傳染性胰臟壞死病毒的快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
傳染幽離壞死病毒的艦微繊l戯離測(cè)方法
獄領(lǐng)域
本發(fā)明屬于水產(chǎn)動(dòng)物病原的檢測(cè)技術(shù)，具體是一種^環(huán)介導(dǎo)^^擴(kuò)增fe^:對(duì)魚(yú)類(lèi)傳染W(wǎng)ffi壞死 病毒進(jìn)行艦檢測(cè)的試劑盒及離測(cè)方法。 背景獄
傳染l4Mfll主壞死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus，簡(jiǎn)稱(chēng)IPNV)屬于雙片段RNA病^4、水 ^^m殺RNA病毒屬'可以引起鮭科 ^苗和幼魚(yú)的急性傳染病，是研^S早的^i毒病。IPNV 対7K產(chǎn)辭1^^了嚴(yán)重的危害，目前魏到加拿大、智利、艘、英國(guó)、法國(guó)、德國(guó)、意大利、日本、 南韓、挪威、勞將蘭、瑞典、美國(guó)、中國(guó)等國(guó)家。易/ife^包括虹鱒、大西洋鮭、五條鯽、大,、歐 洲黃蓋鰈、離業(yè)大西洋鱈等十余種常見(jiàn)辭直魚(yú)類(lèi)?；疾◆~(yú)游動(dòng)異常、體腿黑、目艮突出、腹部腫脹，腹 部包括JH奮出血.、鰓發(fā)白，有l(wèi)彌iLE門(mén)^^長(zhǎng)的、白色的術(shù)世物，內(nèi)臟器官多處出現(xiàn)點(diǎn)狀出血或 發(fā)白，腸道內(nèi)無(wú)內(nèi)含物。鑒于IPNV的嚴(yán)重危害性，世界動(dòng)jtJ衛(wèi)趙且織淑定其為必報(bào)樹(shù)離。中國(guó)國(guó)家質(zhì) 翻督檢驗(yàn)鵬總局與韓國(guó)海洋水/^于2005年發(fā)布加仲韓進(jìn)出口活水生動(dòng)t^驗(yàn)驗(yàn)協(xié)議》中規(guī)定， 我國(guó)和韓國(guó)進(jìn)出口的的艫魚(yú)、真鋼、Mit、都漁、大^l平、牙鄰等必須進(jìn)行傳染牲皿i^E病毒的檢驗(yàn)檢爽。
目前fe^毒的檢測(cè)方法主要包鄉(xiāng)胞學(xué)診斷技術(shù)、免疫學(xué)診斷技術(shù)、肝生物學(xué)診斷技術(shù)三大類(lèi)。 細(xì)胞學(xué)診斷財(cái)主要包^g細(xì)胞歸分離病毒、組彌娜片及電鄉(xiāng)察，其操^M，翻啁賬， 且靈鵬低；免疫學(xué)診斷辦主要包括免疫熒光檢測(cè)、免疫點(diǎn)被，其方法具有特異性強(qiáng)、敏離高的 優(yōu)點(diǎn)，但方法相當(dāng)繁瑣，不適宜X才大量樣品進(jìn)行檢測(cè)；^T生物學(xué)診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)，比較鵬、靈敏，但是需要昂貴的PCR儀器，另夕卜需要瓊脂糖)鵬電泳，溴化乙錠^^見(jiàn)察 結(jié)果，溴化乙錠題癌物，對(duì)人術(shù)卩環(huán)趟有危害，^X污染問(wèn)題比琉^重。
環(huán)介導(dǎo)#^顯擴(kuò)增(Loq>MediatedIso1heimalAmpMcation, Mf爾LAMP)技術(shù)，是一種 性高、特 異性強(qiáng)的耙DNA快速檢測(cè)方法，不需要昂貴的儀器，樣品中含有少量的病原就能檢出。環(huán)介導(dǎo)^T
增目前已Mra^月于檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物病原，如魚(yú)對(duì)離毒(魚(yú)1#血慰舞毒、傳對(duì)Mft壞夕滿毒、傳染性
itlfiL器官壞死病毒、錦魚(yú)腕疹病毒)、X抓卜'病毒(《抓卩白斑it^魏毒、黃彌毒)、細(xì)菌(遲鈍愛(ài)德華
氏菌)等。據(jù)驗(yàn)，目前尚未MOT環(huán)介導(dǎo)^a擴(kuò)增技術(shù)對(duì)傳染性f繊i^E病^a行^i檢測(cè)附隨。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的;l^f共一種利用環(huán)介導(dǎo)^r增技微測(cè)傳染腳^ffi壞鄉(xiāng)毒的檢測(cè)淑!l盒，3￡1野見(jiàn)
有技術(shù)的不足，以滿足5砂湯即H^t測(cè)的要求。
本發(fā)明的另一目的^if共這^^則i^U盒的樹(shù)則方法，以方便 ￡*產(chǎn)#5趙^和國(guó)際 貿(mào)易中對(duì)傳
染l4^fli壞死病Mi行'I^I檢測(cè)中的細(xì)。
本發(fā)明的主要原理為L(zhǎng)AMP S^:^f吏核IiM^，環(huán)境中的循環(huán)置對(duì)廣增實(shí)J股將Em列的放 大，從而超ij樹(shù)則的目的?；竞蘉m敲f對(duì)耙基因的6個(gè)區(qū)域，設(shè)計(jì)2X報(bào)異性引物，同時(shí)可以設(shè)計(jì)l-2條環(huán)引物以加快反應(yīng)速度，利用一種鏈置換脫氧核糖核酸聚合酶(Bacillus stearothomophilus DNA polymerase'簡(jiǎn)禾爾B欲DNA ^^S|)，在恒溫65。C左右SjS^勺lh。 BstDNA^^^f^^性 一是具 有5'-3'聚儒活性，能在傲g狀態(tài)下擴(kuò)增DNA核酸；二是BstDNA聚^H具有鏈置換活性，能將新合 成的核酸單1|/人新 的DNA雙鏈上置樹(shù)取代)下來(lái)，形成兩斜拉的核酸單鏈以開(kāi)啟下^6的DNA 核酸洽成，進(jìn)而免去了每次擴(kuò)增前的DNA變性環(huán)節(jié)。LAMP反;翅:程中， 一對(duì)弓嫩的5'端含有一段 與下^T增產(chǎn)物互補(bǔ)的序列，因此，劍弓l物的單敏，多咸可形成'個(gè)類(lèi)似觀鈴狀的回文結(jié)構(gòu)，這種結(jié) 構(gòu)正好為下一^a置^T增i^Z樹(shù)共了一個(gè)可柳哥而復(fù)始嘲用的徽反，Bst DNA聚合酶^f鏈置換活 性，后階段退火的引物置換前面引物所形成的鏈，從而保證了擴(kuò)增的#^進(jìn)行。LAMPHiS^成一系列 不同長(zhǎng)度的具W^環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA產(chǎn)物，可OT3t熒^^料進(jìn)行檢測(cè)。 本發(fā)明的絲方案如下
傳染14KDK^1^毒的環(huán)介導(dǎo)^^廣增快速檢測(cè)微U盒，包括提供切5^領(lǐng)的BstDNA聚鋪、逆 轉(zhuǎn)錄酶、Si^緩沖液、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增混合液、引物混合液和熒^M色劑，以i^ii乓-種^f頓該微嗆 檢測(cè)魚(yú)，品中傳染腳，壞夕摘'毒的方怯，以實(shí)3^傳染ffiKlt壞死病毒^I檢測(cè)的標(biāo)難化，為 傳染F鵬頓病毒的檢測(cè)提供一種'腿、簡(jiǎn)便、高效、實(shí)用的翻施。。
本發(fā)明的傳染幽瓣￡^毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增|^1檢測(cè)試齊瞼的配方如下
淑[JA: BstDNA聚娜(8U/mL);
淑UB:逆轉(zhuǎn)鵬(200U/nL);
淑U C: SlS緩沖液，樹(shù)共Bst DNA聚^SIftam^;^對(duì)乍用所必須的物質(zhì)，其中含有200 mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲垸-鹽酸(Tris-HCl)、 100 mmol/L氯化鉀(KC1)、 100 mmol/L硫酸銨 ((NH4》S04)、 80mmol/L硫酸雙(MgS04)和1X曲拉通X-100 (TritonX陽(yáng)100);
試劑D:環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增混合液，其中含有4.0ML2.5mmo]/LdNTP、 2.0nL10mol/L舌甘菜堿、0.5jjL 200U/hLRNA ,制剤和5-6mL針生物學(xué)MM7K;
i敘'J E:弓l物混合液，其中含有2 pL20 Mmol/L正向內(nèi)弓物、220 ^mol/L反向內(nèi)弓物、1 5Mmol/L 正向夕卜弓嫩、lML5Mmol/L反向外引物和lML20Mmol/L環(huán)引物；其中引物序列分別如下 正向內(nèi)弓嫩5'- GGCCCCGTTCAITGACTGGArnTGACAAGCCATACGTCCGC -3'; 反向內(nèi)弓嫩5'- CGGAGGTACGAGATCGACCTCCnTTCCCTCGTAGAGAGTGGTGAG -3'; 正向夕卜弓l物5'- CCAAAGGAGTCACAGTCCTG -3'; 反向外引物5'-GTTGACGATGTCGGCGTT-3'; 環(huán)引物5'-TGGGGTGTCTCGTCCTCTA-3'。
淑1JF:熒M色劑，成分為醇的熒光染料SYBRGREENI 。 采用傳染蹈劍主壞歹膽毒的環(huán)介導(dǎo)等顯擴(kuò)堪葉ifcii齒則試劑盒的檢測(cè)方法如下
(1) 待檢樣品的RNA的提取.-用商業(yè)化的試劑盒或者傳統(tǒng)的方^I取待檢樣品的RNA，用核酸分析儀測(cè)定RNA，保證其ODW
OD280在1.7-2.0范圍內(nèi)，調(diào)整^ 度在100-200ng/^L之間。
(2) 進(jìn)行傳染幽鵬諷病毒的環(huán)介導(dǎo)等尉廣增鵬取一個(gè)0.2mL的聚丙烯塑料管，力口入1-2mL的歩驟(1)提取的待測(cè)樣品的RNA，再加入lpL試 劑A,卞L試劑B， 2.5ML試劑C， 11.5-12.5pL試劑D， 8pL淑UE，使得切立&#|只為25pL。其中引 物序列分別如下
正向內(nèi)弓l物5'- GGCCCCGTTCAITGACTGGArnTGACAAGCCArACGTCCGC -3'; 反向內(nèi)引物5'-CGGAGGTACGAGATCGACCTCCnTTCCCTCGTAGAGAGTGGTGAG-3'; 正向夕卜弓l物5'- CCAAAGGAGTCACAGTCCTG -3'; 反向外引物5'-GTTGACGATGTCGGCGTT-3'; 環(huán)弓(物5'- TGGGGTGTCTCGTCCTCTA-3'。
將戰(zhàn)塑料管置于60^5'C的恒澄o7K鵬中，放置40"60min進(jìn)fi環(huán)介導(dǎo)樂(lè)融"增腿；之后將水溫 再調(diào)到80-95。C，放置3-5min以終ih^應(yīng)，取出含擴(kuò)增產(chǎn)吻的塑料管待檢。 (3)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)
在步驟(2)的待,料管中加入lMLi敘UF，混合均勻，卿歐見(jiàn)察產(chǎn)物的鵬。如果為鄉(xiāng)絶，則 判定待檢樣品含有傳染幽M^死病毒；如果為m，貝(J判定待檢樣品不含有傳染(Wi壞夕満毒。 本發(fā)明建立的傳染鵬鄉(xiāng)壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)織擴(kuò)增纖,敘翻施，可卿各種fe^別題 鲆、大,、艫魚(yú)、真鯛等祥品進(jìn)行'Kii檢測(cè)。 與現(xiàn)有技^ffl比，本發(fā)明的有益^S包括
第一，本發(fā)明不需要g^的儀器，不需^lt^i式劑，只需一直定S^就能Si立，能滿足救湯及, 測(cè)的要求，操作簡(jiǎn)單簡(jiǎn)便。
第二本發(fā)明包括DNA提取、環(huán)介導(dǎo)^a擴(kuò)增Si^、 ；^tJ^測(cè)3 4^:程，在不到3小時(shí)內(nèi)即可完 成，檢測(cè)時(shí)間短。
第三，本發(fā)明的擴(kuò)增模教可僅為10拷貝甚至更少，產(chǎn)量可達(dá)到10^101()個(gè)拷貝，靈鵬高。 第四，本發(fā)明擴(kuò)增tim列的六個(gè)區(qū)段，并5i^個(gè)區(qū)段,imfe有規(guī)定，因此具有高度特異性。 第五，本發(fā)明的LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物可以與熒^^料結(jié)合，卿歐見(jiàn)察就可以謝彌果判定，簡(jiǎn)便高效。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明{鵬一步怖詳細(xì)說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。 織例l
按照下歹鵬己方制作傳染幽鄉(xiāng)壞夕滿-毒的環(huán)介導(dǎo)等sr增tfei檢領(lǐng)賦齊i傖。
鄉(xiāng)A: l単BstDNA聚鏑(8U4iL); 淑[]B: 1.0nL逆lf^ (200U/mL);
試劑C: 2.5pL反應(yīng)緩沖液，其中含有200mmol/LpH8.8的三!速甲基賨謹(jǐn)甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、 10Ommol/L氯化鉀(KC1)、 10Ommol/L硫,((NH4》s04)、 80mmol/L硫ltf美(MgS04)禾口1%曲拉 通X掘(TritonX-100);
i^UD: 不介導(dǎo)^a擴(kuò)i曾 昆^"液，其中^W4.0nL2.5mmol/LdNTP、 2.0ML10mol/LSt皿、0.5^L 200U爾L膽,塘擠辟口5pL好生物學(xué)繊脈，共計(jì)ll單；試劑E:弓l物混合液，其中含有2 mL20 Mmol/L正向內(nèi)弓胸、2 mL 20 pnol/L反向內(nèi)引物、1 pL 5Mmol/L 正向夕卜弓物、iiL5nmo]/L反向外引物和lML20Mmol/L環(huán)引慨共討'7^L。其中引物序列分別如下 正向內(nèi)弓胸5'- GGCCCCGTTCATTGACTGGATnTGACAAGCCArACGTCCGC -3'; 反向內(nèi)弓l物5'-CGGAGGTACGAGATCGACCTCCinTCCCTCGTAGAGAGTGGTGAG-3'; 正向夕卜弓l物5'- CCAAAGGAGTCACAGTCCTG -3'; 反向外引物5'-GTTGACGATGTCGGCGTT-3'; 環(huán)弓l物5'- TGGGGTGTCTCGTCCTCTA-3'。
試劑F: 1.0pL熒;)t顯色劑，成分為100x的熒光染料SYBRGREENI。
按照以下辦謝灘測(cè)
(1) 待檢樣品脆的提恥
待檢樣品為某翁直場(chǎng)謝!^M專(zhuān)染性MffiiPE病毒的虹鱒，魚(yú)#^異常、體色發(fā)黑、目艮突出、腹部
月中脹，Jt部包括職耆出血、鰓發(fā)白。
^ffl^S生物Xg公司的核^i取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣品RNA的提取。用核,析儀測(cè) 定虹f辭羊品的RNA OEWOD28o為1.8，調(diào)整RNA,為100ng/^L。
(2) 進(jìn)份專(zhuān)染,主艦病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增鵬 首先取一個(gè)0.21111的聚丙烯塑料管，力口A^驟(1)提取的虹鱒樣品的RNA2.0ML，再加入lnL試
劑A， lpL試劑B， 2.5pL試劑C， 11.5pL試劑D， 7pL試劑E，使得SR^^只為25nL。
將，塑料管置于6CTC盼恒澄jJC^中，放置401^謝罰^導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增皿；之后將水^^源搜 再調(diào)到8(TC， ^C置5min以終jbg應(yīng)，取出含擴(kuò)增 ^的塑料管待檢。
(3) 擴(kuò)增產(chǎn)物的雖
在步驟(2)的待檢的塑料管中力口入1mL i敘U F，混合均勻，卿歐見(jiàn)察產(chǎn)物的Mfe。鵬^物顏色 為ftfe，據(jù)此判定該待檢樣品虹鱒中含有傳染ffiKffi壞死病毒。 鄉(xiāng)例2
按照下列配方制作傳染Mft頓病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫廣增鵬檢測(cè)試齊瞼。 試劑A、 i敘ijB、 i敘(JC、試劑E同實(shí)施例1。
試劑d:環(huán)介導(dǎo)^Sf增混合液，其中含有4.0ML2.5mmol/LdNTP、 2.0& 10mo]/Lffl^ 、 0.5mL 200 U /mLRNA Hfflr制劑禾口 6pL分子生物學(xué)M^foK;共計(jì)12.5 ^l。 i翁ljE:同實(shí)施例l。 按照以Tf呈序進(jìn)行德 (1)樣品RNA的提取
樣品為/媒國(guó)進(jìn)口的大,樣品，夕卜觀正常。
禾傭傳統(tǒng)的TRlZOL方iSa行大^f樣品的RNA的提取，參照肝克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)。具體 步驟為取50mg大gif腦、腎、脾等組織逆行勻漿，加入600piLTRIZOLl^，顛倒混勻，再加入200 pL氯仿，混勻器上震蕩混勻5sec。于4。C 12000 ipm離心15min。吸取上清液500pL，力口入400iiiL異丙 醇，誦20。C驢30併中。12000 rpm離心15min，倒去上清；然后加入600 (xL75。/。乙醇，洗滌沉淀，于2000
6rpm離心5min，輕紐到去上清。將RNA沉淀室溫干燥3min后，力口入20pL7乂，輕輕混勻，溶解管壁上 的RNA。 2000tpm離心5sec，在冰上保存?zhèn)溆?。用核酸分析儀測(cè)定大穀平樣品的RNA ODWOQzs^J 2.0，調(diào)整RNA濃度為100ng/nL。
(2) 進(jìn)行傳染,主壞死病毒的騎導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增鵬 首先取一個(gè)0.2mL的聚丙烯塑料管，力口Aii^驟(1)提取的大^I平樣品的RNA1.0ML，再加入1^L
鄉(xiāng)A， lpL試劑B， 2.5ML試劑C， 12早試劑D， 7fjL試劑E，使得鹓,只為25nL。
將上述塑料管置于63。C盼恒^7j^B咼中，放置60min謝fSf介導(dǎo)等顯擴(kuò)增鵬；之后將水^^gj變 再調(diào)到85。C，放置3min以終止反應(yīng)，取出含擴(kuò)增，的塑料管待檢。
(3) 擴(kuò)墻,的檢測(cè)
在步驟(2)的待檢塑料管中力口入lpLi敘ijF，混合均勻，肉B歡見(jiàn)察，的顏色。鵬產(chǎn)物鵬為 ，據(jù)此判定待檢樣品大^I平中不含有傳染幽MB^E病毒。 實(shí)施例3
按照同實(shí)施例2的配方制作傳染iWi壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增Kii檢測(cè)試劑盒。
按照以下程細(xì)亍檢測(cè)
(1) 樣品RNA的提取
樣品為某^M場(chǎng)采集的魚(yú)盧魚(yú)，外觀正常。
取50mg艫Mf臟組織，樣品的RNA的提取方法同實(shí)施例2。用核酸^W斤儀測(cè)定艫魚(yú)樣品的RNA ODW OD280為1.8，調(diào)整RNA濃度為100 ng/pL。
(2) 進(jìn)行傳染wi;頓病毒的環(huán)介導(dǎo)等顯擴(kuò)增鵬
取一個(gè)0-2mL的聚丙烯塑料管，力口A^驟(1)提取的艫魚(yú)樣品的RNA1.(^L，再加入其它幼頓 分同實(shí)施例2。
將上述塑料管置于65。C盼度f(wàn)eK辦咼中，放置50min進(jìn)稱(chēng)介導(dǎo)魏擴(kuò)增鵬之后將7jC,溫 度再調(diào)到82。C，放置3min以終止切歪，取出含擴(kuò)增產(chǎn)物的塑料管待檢。
(3) 擴(kuò)增產(chǎn),的檢測(cè)
在步驟(2)的待檢塑料管中力U入lML試劑F，混合均勻，肉目歐見(jiàn)察;^tl的jm。 aSrtlMfe為
m，據(jù)此判定待檢樣品艫魚(yú)中不含有傳染性:MK^E^毒。核苷酸序列表
<110> 11.l東出入境檢驗(yàn)^S^檢驗(yàn)^g駄中心
<120>傳染,主壞歹摘毒的鵬檢測(cè)試齊!1^微測(cè)施
<160> 5
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> AXiW!l <220>
<221> primer—bind
<222> (1)...(42)
々23>根據(jù)環(huán)介導(dǎo)等顯擴(kuò)增M^要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增傳染幽M;^E病毒的正向內(nèi)引物。
<400> 1
ggccccgttc attgactgga ttttgacaag ccatacgtcc gc 42
<210> 2 <211> 46 <212> DNA <213> Alff列 <220>
<221> primer—bind <222> (1)…(46)
<223>臓環(huán)介導(dǎo)^T增幼歪要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增傳染性MSi^毒的反向內(nèi)引物。 <400> 2
cggaggtacg agatcgacct ccttttccct cgtag^agt ^tgag 46
<210> 3
<211> 20
〈12> DNA
<213> ^0列 <220><221> primer—bind
<222> (1)…(20)
<223> l離環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增SiS要求設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增傳染W(wǎng)Ki^E病毒的正向外引物。
<400> 3
ccaaaggagt cacagtcctg 20
<210> 4
〈11> 18
<212> DNA <213>人工序列 <220>
<222> (1)…(18)
《23> 根據(jù)環(huán)介導(dǎo)等顯擴(kuò)增i^應(yīng)要求設(shè)i卜，用于擴(kuò)增傳染性^te^E病毒的反向外引物。
<400> 4
gttgacgatg teggcgtt
〈10> 5
〈11> 19
々12> DNA <313>人工序列 <220>
<221> primer_bind
<222> (1)…(19)
<223>根據(jù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增鵬要求設(shè)計(jì)，
,0> 5
tggggtgtct cgtccteta
18
用于擴(kuò)增傳對(duì)^UK^t毒的環(huán)弓卿。
19
權(quán)利要求
1. 一種傳染性胰臟壞死病毒的快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于試劑盒中包括試劑A-F試劑ABstDNA聚合酶，8U/μL；試劑B逆轉(zhuǎn)錄酶，200U/μL；試劑C反應(yīng)緩沖液，其中含有200mmol/LpH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、80mmol/L硫酸鎂和1％曲拉通X-100；試劑D環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增混合液，其中含有4.0μL2.5mmol/LdNTP、2.0μL10mol/L甜菜堿、0.5μL200U/μLRNA酶抑制劑和5-6μL分子生物學(xué)級(jí)超純水；試劑E引物混合液，其中含有2μL20μmol/L正向內(nèi)引物、2μL20μmol/L反向內(nèi)引物、1μL5μmol/L正向外引物、1μL5μmol/L反向外引物和1μL20μmol/L環(huán)引物；其中引物序列分別如下正向內(nèi)引物5′-GGCCCCGTTCATTGACTGGATTTTGACAAGCCATACGTCCGC-3′；反向內(nèi)引物5′-CGGAGGTACGAGATCGACCTCCTTTTCCCTCGTAGAGAGTGGTGAG-3′；正向外引物5′-CCAAAGGAGTCACAGTCCTG-3′；反向外引物5′-GTTGACGATGTCGGCGTT-3′；環(huán)引物5′-TGGGGTGTCTCGTCCTCTA-3′。試劑F熒光顯色劑，成分為100×的熒光染料SYBR GREENI。
2.利用權(quán)利要求l中戶脫的'I^I檢測(cè)微!J^4行傳染W(wǎng)K:^E病毒的樹(shù)則方法，辦征在于檢測(cè) 辦如下(1) 待檢樣品的RNA的提取提取待檢樣品的RNA，保i正RNAOEWOD28o在1.8-2.0范圍內(nèi)，調(diào)整^g在100-200ng/nL之間；(2) 謝亍傳染TOlfti^毒的環(huán)介導(dǎo)離擴(kuò)增鵬首先取一個(gè)0.2mL的聚丙烯塑料管，加入1-2ML的步驟(1)提取的待測(cè)樣品的RNA，再加入1mL 縱IJA， lpL試劑b， 2.5nL試劑C， 11.5-12,5nL試劑d， 7^L試劑E，使得Si^^、^f只為25mL。然后 將戰(zhàn)塑料管置于60必。C的恒^7K鵬中，方燈40"60min;之后將水溫再調(diào)到80-95°C，方燈3-5min 以終ib^，取出含擴(kuò)增產(chǎn)物的塑料管待檢。(3) 擴(kuò)增^l的衞則在步驟(2)的待,料管中力口入1mL微U F，混合均勻，肉目歐見(jiàn)察，的Mfe，如果為鄉(xiāng)絶，則 判定待檢樣品含有傳染!4^li^E病毒；如果為m，貝,定待檢樣品不含有傳染幽^ffii^E病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種傳染性胰臟壞死病毒的快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明包括由Bst DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、反應(yīng)緩沖液、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增混合液、引物混合液和熒光顯色劑共6種試劑組成的試劑盒，以及使用該試劑盒檢測(cè)魚(yú)類(lèi)樣品中傳染性胰臟壞死病毒的一套檢測(cè)操作程序，以實(shí)現(xiàn)對(duì)傳染性胰臟壞死病毒快速檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化，為魚(yú)類(lèi)的健康養(yǎng)殖和國(guó)際魚(yú)類(lèi)貿(mào)易的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明具有特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、高效等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛的應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)以及進(jìn)出口魚(yú)類(lèi)貿(mào)易中的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)，并可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，具有廣泛應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101457260SQ20081016060
公開(kāi)日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2008年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日
發(fā)明者凌宗帥, 葒 劉, 岳志芹, 健 張, 張?zhí)? 朱來(lái)華, 瓊 李, 梁成珠, 肖西志, 辛學(xué)謙, 鄧明俊, 鄭小龍 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心