本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種與箭筈豌豆耐寒性相關(guān)的indel分子標(biāo)記vs_chr1_34169935及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

0、技術(shù)背景

1、極端氣候是影響植物分布的重要因素。在我國北方地區(qū)，低溫脅迫顯著影響作物的生命周期。因此，選育耐低溫的箭筈豌豆(vicia?sativa?l.)種質(zhì)，對(duì)于延長其生長周期、提高產(chǎn)量和擴(kuò)大分布范圍至關(guān)重要。由于箭筈豌豆的育種起步較晚，關(guān)于分子標(biāo)記的開發(fā)與定位的研究仍相對(duì)有限。因此，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)合分子標(biāo)記開發(fā)與寒冷抗性相關(guān)的標(biāo)記，將有助于預(yù)測和篩選耐寒種質(zhì)，這對(duì)構(gòu)建輔助選擇育種體系、改善種質(zhì)資源及育成新品種具有重要意義。

2、全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide?association?study,gwas)是一種通過比較不同個(gè)體的基因組數(shù)據(jù)來識(shí)別與特定性狀相關(guān)的遺傳變異的方法，且與分子標(biāo)記之間有著密切的聯(lián)系，它們?cè)谶z傳研究和育種中的應(yīng)用相輔相成。gwas可以識(shí)別與目標(biāo)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，這些標(biāo)記可以用于后續(xù)的選擇育種。通過使用這些標(biāo)記，育種者可以更有效地篩選出具有優(yōu)良性狀的個(gè)體，從而加速育種過程。因此，分子標(biāo)記的開發(fā)和輔助選擇育種在箭筈豌豆中逐步展開，但目前仍缺乏大量可靠的分子標(biāo)記。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于提供與箭筈豌豆耐寒性狀相關(guān)的indel分子標(biāo)記。。

2、本發(fā)明的目的之二在于提供一種箭筈豌豆耐寒性狀鑒定方法。

3、本發(fā)明的目的之三在于提供上述與箭筈豌豆耐寒性狀相關(guān)的indel分子標(biāo)記的應(yīng)用。

4、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：

5、本發(fā)明公開的與箭筈豌豆耐寒性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，位于箭筈豌豆第1號(hào)染色體上，所述分子標(biāo)記命名為vs_chr1_34169935。

6、擴(kuò)增與箭筈豌豆耐寒性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的引物對(duì)，所述分子標(biāo)記vs_chr1_34169935對(duì)應(yīng)的引物對(duì)序列為：

7、vs_chr1_34169935-f：caacgcataaccagcataag；

8、vs_chr1_34169935-r：tatagtggaatgcatgaatatcacat。

9、本發(fā)明還公開了上述分子標(biāo)記引物對(duì)在箭筈豌豆耐寒性狀輔助育種中的應(yīng)用。也就是說本發(fā)明的分子標(biāo)記可用于今后的分子標(biāo)記輔助育種中，通過苗期提取葉片的dna，檢測是否存在本發(fā)明的分子標(biāo)記，進(jìn)而來鑒定箭筈豌豆材料的耐寒性。所述檢測可以使用pcr檢測的方法，具體可以使用上述的分子標(biāo)記引物對(duì)，所述檢測還可以通過測序方法進(jìn)行。

10、本發(fā)明還公開了上述分子標(biāo)記在鑒定箭筈豌豆耐寒性中的應(yīng)用，尤其是在篩選和鑒定箭筈豌豆耐寒性高低中的應(yīng)用，具體地，用于鑒定箭筈豌豆是否具有高耐寒性狀具體步驟如下：

11、(1)以供試種質(zhì)的dna為pcr擴(kuò)增的模板，以上述分子標(biāo)記vs_chr1_34169935對(duì)應(yīng)的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系如表1：

12、表1?pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系

13、 試劑 加入體積(μl) 基因組dna 0.5 2×pcr?mix 5 上游引物 0.5 下游引物 0.5 滅菌蒸餾水 3.5 總體積 10

14、94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸6s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

15、(2)pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測：取5μl?pcr產(chǎn)物，根據(jù)條帶的結(jié)果判斷箭筈豌豆耐寒性的結(jié)果。

16、利用引物對(duì)vs_chr1_34169935-f、vs_chr1_34169935-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物僅有一條如seq?id?no.4所示的長度為192bp的特征條帶，則箭筈豌豆為不耐寒類型；如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物僅有一條如seq?id?no.5所示的長度為128bp的特征條帶，則箭筈豌豆為耐寒類型。

17、另外，本發(fā)明還保護(hù)一種用于鑒定箭筈豌豆耐寒性狀高低的試劑盒，所述試劑盒中包含引物對(duì)vs_chr1_34169935-f、vs_chr1_34169935-r。所述試劑盒的其它成分均屬于常規(guī)的試劑。具體還包括10×pcr?buffer、dntp和taq?dna聚合酶。本發(fā)明對(duì)所述引物對(duì)的濃度沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域所熟知的引物濃度即可。本發(fā)明對(duì)所述10×pcr?buffer、dntp和taq?dna聚合酶的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域所熟知的普通pcr擴(kuò)增用試劑即可。

18、采用本發(fā)明的試劑盒可以快速的鑒定箭筈豌豆材料的耐寒性狀，還可以快速的鑒定箭筈豌豆材料的耐寒性狀相關(guān)基因型。具體方法參照鑒定箭筈豌豆是否具有高耐寒性的具體步驟，通過對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物僅有一條如seq?id?no.4所示的長度為192bp的特征條帶，則箭筈豌豆為不耐寒類型；如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物僅有一條如seqid?no.5所示的長度為128bp的特征條帶，則箭筈豌豆為耐寒類型。

19、本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

20、(1)本發(fā)明的發(fā)明人篩選出了一個(gè)與箭筈豌豆耐寒性狀相關(guān)的分子標(biāo)記vs_chr1_34169935，該分子標(biāo)記位于1號(hào)染色體上，采用本發(fā)明的分子標(biāo)記vs_chr1_34169935可以快速地對(duì)箭筈豌豆的耐寒性狀高低進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。

21、(2)用與耐寒性狀相關(guān)的標(biāo)記來進(jìn)行篩選，有利于分子標(biāo)記輔助選擇育種，其方法簡單可行，有利于提高效率，節(jié)省成本。

22、(3)本發(fā)明的分子標(biāo)記具有檢測方便、擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定、特異性高的特點(diǎn)，可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于箭筈豌豆高耐寒性狀育種實(shí)踐及材料鑒定。

技術(shù)特征：

1.與箭筈豌豆耐寒性相關(guān)的分子標(biāo)記vs_chr1_34169935，其特征在于，所述分子標(biāo)記vs_chr1_34169935位于箭筈豌豆第1號(hào)染色體上，所述分子標(biāo)記vs_chr1_34169935對(duì)應(yīng)的引物對(duì)序列為：

2.權(quán)利要求1中所述的分子標(biāo)記vs_chr1_34169935在箭筈豌豆分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述分子標(biāo)記vs_chr1_34169935用于鑒定或輔助鑒定箭筈豌豆的耐寒性狀高低。

4.一種箭筈豌豆耐寒性狀鑒定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

5.一種用于箭筈豌豆耐寒性鑒定的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1中所述的引物對(duì)。

6.權(quán)利要求5所述的試劑盒在鑒定箭筈豌豆耐寒性狀或耐寒基因型方面的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，利用所述試劑盒對(duì)箭筈豌豆耐寒基因型進(jìn)行鑒定的方法為：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種位于1號(hào)染色體上與箭筈豌豆耐寒性相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，在箭筈豌豆中定位到一個(gè)InDel位點(diǎn)，命名為Vs_Chr1_34169935，插入或缺失片段的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.3所示。用于擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1～2所示。本發(fā)明所述分子標(biāo)記及其引物對(duì)能夠鑒定或輔助鑒定箭筈豌豆耐寒性狀。同時(shí)本發(fā)明還提供了利用所述分子標(biāo)記快速鑒定箭筈豌豆耐寒性的方法，該方法簡便快捷，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，具有良好的推廣應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：劉文獻(xiàn),李艷鵬,楊正榮,劉志鵬
受保護(hù)的技術(shù)使用者：蘭州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21