本發(fā)明涉及病原檢測(cè)，具體涉及了一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增協(xié)同納米生物傳感技術(shù)同時(shí)檢測(cè)乙肝和丙肝病毒的檢測(cè)系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

1、乙型肝炎病毒(hbv)和丙型肝炎病毒(hcv)是導(dǎo)致嚴(yán)重肝臟疾病如肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌的兩大主要原因。hbv和hcv均為血源性病原體，主要通過(guò)受感染的血液接觸、不安全的性行為、注射毒品使用、針刺傷及垂直傳播等方式傳播。大多數(shù)人在新感染hbv或hcv時(shí)無(wú)癥狀，隨著病情發(fā)展，他們可能成為慢性病毒攜帶者。2016年，世界衛(wèi)生組織(who)啟動(dòng)了一項(xiàng)雄心勃勃的策略，旨在到2030年消除病毒性肝炎作為公共衛(wèi)生威脅。然而，世衛(wèi)組織表示，盡管取得了一些成就，但到2022年，大多數(shù)全球目標(biāo)尚未實(shí)現(xiàn)。hbv和hcv的診斷不足仍是消除病毒性肝炎作為公共衛(wèi)生威脅的一個(gè)關(guān)鍵障礙，近80％的hbv或hcv感染者仍未得到診斷。因此，開發(fā)一步到位、成本節(jié)省、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高且特異性強(qiáng)的即時(shí)檢測(cè)平臺(tái)，用于hbv和hcv篩查，對(duì)于治療和控制進(jìn)一步傳播至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)檢測(cè)乙肝和丙肝病毒的檢測(cè)系統(tǒng)，以解決現(xiàn)有技術(shù)中缺少可以同時(shí)檢測(cè)hbv和hcv的耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單和檢測(cè)靈敏度高的檢測(cè)系統(tǒng)的技術(shù)問(wèn)題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)檢測(cè)乙肝和丙肝病毒的檢測(cè)系統(tǒng)，包括m-lamp單元和檢測(cè)單元；所述m-lamp單元用于在同一反應(yīng)體系中同時(shí)對(duì)乙肝病毒的s基因和丙肝病毒的5'utr基因進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；乙肝病毒包括b亞型、c亞型、d亞型、重組b/c亞型和重組c/d亞型中的至少一種；丙肝病毒包括1b亞型、2a亞型、3a亞型、3b亞型和6a亞型中的至少一種。

4、上述技術(shù)方案提供了一種新的用于檢測(cè)乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的分子診斷方法。這種方法結(jié)合了多重環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和基于金納米顆粒的側(cè)流生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確的病毒檢測(cè)。

5、通過(guò)結(jié)合多重lamp等溫?cái)U(kuò)增方法和aunps-lfb，成功開發(fā)了一種新型的mlamp-aunps-lfb檢測(cè)，用于在臨床應(yīng)用中對(duì)hbv和hcv的高度敏感和特異、用戶友好、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且快速的識(shí)別。整個(gè)診斷過(guò)程可以在50分鐘內(nèi)完成，無(wú)需特定儀器。我們的檢測(cè)具有20拷貝的lod，與其他病原體無(wú)交叉反應(yīng)。因此，我們的mlamp-aunps-lfb檢測(cè)是快速、特異、敏感、可視化和用戶友好的hbv和hcv識(shí)別的寶貴工具，并作為hbv和hcv感染篩查的poc檢測(cè)方法具有巨大潛力。

6、進(jìn)一步，乙肝病毒的s基因的引物組合如下：

7、hbv-f3：5′-tgtacmaaacctwcggacgg-3′；

8、hbv-b3：5′-gtaayagmggyawaaaggga-3′；

9、hbv-fip：5′-gaggcccactcccataggwat-gcacytgtattcccatccca-3′；

10、hbv-bip：5′-tgccatttgttcagtggttcgt-tggcccccaataccacatc-3′；

11、hbv-lf：5′-ttscgaaagcccargatg-3′；

12、hbv-lb：5′-tggctttcagttatatg-3′；

13、丙肝病毒的5'utr基因的引物組合如下：

14、hcv-f3：5′-agtgtcgtrcagcctcc-3′；

15、hcv-b3：5′-ggcctttcgcracccaa-3′；

16、hcv-fip：5′-cdyccyrgcrattccggtgt-cctcccgggagagccatag-3′

17、hcv-bip：5′-ttgganmaacccrctcwatrcc-crctactcggctagyrrtct-3′；

18、hcv-lf：5′-tcaccggttccgcagac-3′；

19、hcv-lf*：5′-biotin-tcaccggttccgcagac-3′；

20、hcv-lb：5′-gmvatttgggcgtgcccccg-3′；

21、其中，hbv-fip的5′端可選擇第一標(biāo)記分子修飾或不修飾；hbv-lf的5′端可選擇第三標(biāo)記分子修飾或不修飾；hcv-fip的5′端可選擇第二標(biāo)記分子修飾或不修飾；hcv-lf的5′端可選擇第三標(biāo)記分子修飾或不修飾。

22、進(jìn)一步，hbv-f3和hcv-f3、hbv-b3和hcv-b3、hbv-fip和hcv-fip、hbv-bip和hcv-bip、hbv-lf和hcv-lf、hbv-lb和hcv-lf的濃度比為1：2.5。

23、進(jìn)一步，所述第一標(biāo)記分子為羧基熒光素，所述第二標(biāo)記分子為地高辛，所述第三標(biāo)記分子為生物素。

24、進(jìn)一步，所述m-lamp單元還包括bst?2.0?dna聚合酶、dntp混合物和緩沖液。

25、進(jìn)一步，所述m-lamp單元的工作溫度為63℃，所述m-lamp單元的工作時(shí)長(zhǎng)為35min。

26、進(jìn)一步，系統(tǒng)的檢測(cè)下限為20拷貝/反應(yīng)。

27、進(jìn)一步，所述m-lamp單元的工作溫度為63℃，所述m-lamp單元的工作時(shí)長(zhǎng)為40min。

28、進(jìn)一步，所述檢測(cè)單元為基于金納米粒子的側(cè)流生物傳感器；基于金納米粒子的側(cè)流生物傳感器包括依次固定在背板上的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜及吸水墊；硝酸纖維素膜上設(shè)置有測(cè)試線1、測(cè)試線2和質(zhì)控線。

29、進(jìn)一步，測(cè)試線1、測(cè)試線2和質(zhì)控線上分別固定有羧基熒光素抗體、地高辛抗體以及生物素化的牛血清白蛋白。

30、進(jìn)一步，結(jié)合墊中含有深紅色染料偶聯(lián)的鏈霉親和素包被的金納米粒子。

31、本技術(shù)方案的技術(shù)原理和有益效果在于：

32、本技術(shù)方案成功設(shè)計(jì)了一種新穎的方法，將多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(mlamp)與基于aunps的lfb平臺(tái)集成，通過(guò)分別靶向hbv的s基因和hcv的5'非翻譯區(qū)(5'-utr)基因，實(shí)現(xiàn)了對(duì)hbv和hcv敏感、特異、快速和可視的鑒定。通過(guò)檢測(cè)疑似hbv/hcv感染患者的臨床樣本，驗(yàn)證了這一新型診斷方法的可行性。

33、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(lamp)是一種創(chuàng)新的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)即時(shí)護(hù)理核酸測(cè)試具有巨大潛力，能夠利用嗜熱脂肪芽孢桿菌(bst)dna聚合酶和特定引物集，在恒定溫度下強(qiáng)健且特異地?cái)U(kuò)增目標(biāo)基因。lamp引物集合包含六個(gè)引物(前向外引物f3、后向外引物b3、前向內(nèi)引物fip、后向內(nèi)引物bip、前向環(huán)引物lf和后向環(huán)引物lb)，它們專門識(shí)別目標(biāo)序列的八個(gè)區(qū)域。lamp反應(yīng)為經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且可靠的方法，具有顯著優(yōu)勢(shì)。

34、基于金納米粒子的側(cè)向流生物傳感器(aunps-lfbs)作為一種poc診斷平臺(tái)，由于其高靈敏度和特異性、簡(jiǎn)單的測(cè)試程序、便攜性、一步法、長(zhǎng)期穩(wěn)定性、快速檢測(cè)能力、肉眼可視讀出以及低成本，具有顯著優(yōu)勢(shì)。

35、病毒性肝炎主要由乙型肝炎病毒(hbv)和丙型肝炎病毒(hcv)感染引起，仍然是全球公共衛(wèi)生的重大關(guān)注點(diǎn)，特別是在低收入和中等收入國(guó)家?？焖俸?jiǎn)便的即時(shí)診斷平臺(tái)對(duì)于有效治療和控制這些感染至關(guān)重要。在此，我們首次報(bào)道了一種稱為多重環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增與金納米顆?；鶄?cè)流生物傳感器相結(jié)合的新型分子診斷試驗(yàn)(mlamp-aunps-lfb)，該試驗(yàn)用于一步法、快速、靈敏、特異且可視化地識(shí)別hbv和hcv?；谥袊?guó)主要hbv基因型(b、c、d、b/c重組和c/d重組)和hcv亞型(1b、2a、3a、3b和6a)的s基因和5'-非編碼區(qū)(5'-utr)設(shè)計(jì)了兩組lamp引物。確定mlamp-aunps-lfb試驗(yàn)的最佳反應(yīng)條件為63℃，持續(xù)35min。檢測(cè)過(guò)程包括快速核酸分離(10?min)、mlamp(35?min)和可視化解讀(不到2?min)，可在50?min內(nèi)完成。我們的試驗(yàn)檢測(cè)下限為每測(cè)試20拷貝，對(duì)實(shí)驗(yàn)病原體的特異性為100％。因此，初步結(jié)果表明，我們的mlamp-aunps-lfb試驗(yàn)是一種有價(jià)值的工具，作為hbv和hcv識(shí)別的即時(shí)檢測(cè)方法具有巨大潛力。