本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種用于膀胱癌檢測(cè)的dna甲基化生物標(biāo)志物組合及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、膀胱癌作為一種常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，全世界每年大約有50萬(wàn)膀胱癌新發(fā)病例并有20萬(wàn)人因此死亡(richters?a,aben?k,kiemeney?l.the?globalburden?of?urinarybladder?cancer:an?update[j].springer?berlin?heidelberg,2020.)。因此，早期診斷對(duì)于防止早期膀胱癌發(fā)展到肌層浸潤(rùn)階段和高級(jí)別膀胱癌至關(guān)重要。早期診斷和手術(shù)及術(shù)后長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)是膀胱癌治療的重要組成部分。

2、目前針對(duì)膀胱的檢查方法主要有尿液檢查、影像學(xué)檢查、膀胱鏡檢查等，尿液檢查中，尿常規(guī)檢查可早期發(fā)現(xiàn)鏡下血尿，尿脫落細(xì)胞檢查可檢測(cè)腫瘤細(xì)胞，但兩者檢測(cè)靈敏度低，易于漏檢(roghmann?f,goebell?p?j,dyrskjot?l,et?al.sensitivity?andspecificity?in?urine?bladder?cancer?markers-is?it?that?simple？comment[j].bladder?cancer.2022(1):8.)。深入研究膀胱癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，不斷尋找新的腫瘤分子生物標(biāo)志物，對(duì)膀胱癌的早期診斷、治療和預(yù)后提供新的方案，有非常重要的意義。一些研究表明尿液中脫落細(xì)胞相關(guān)基因的甲基化cpg位點(diǎn)可以作為檢測(cè)或監(jiān)測(cè)膀胱癌的有前途的標(biāo)記物。

3、但現(xiàn)有的用于膀胱癌檢測(cè)的dna甲基化生物標(biāo)志物存在靈敏度低和特異性差等問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種用于膀胱癌檢測(cè)的dna甲基化生物標(biāo)志物組合及其應(yīng)用。解決現(xiàn)有的用于膀胱癌檢測(cè)的dna甲基化生物標(biāo)志物存在靈敏度低和特異性差等問(wèn)題。

2、在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于膀胱癌檢測(cè)的dna甲基化生物標(biāo)志物組合，包括twist1(twist?family?bhlh?transcription?factor?1)基因的seq?idno.1序列、onecut2(one?cut?homeobox?2)基因的seq?id?no.2序列、vim(vimentin)基因的seq?idno.3序列和cdo1(cysteine?dioxygenase?type?1)基因的seq?id?no.4序列中至少兩種由cg指示的甲基化位點(diǎn)的組合。

3、本發(fā)明提供的dna甲基化生物標(biāo)志物組合中，例如可以?xún)H包括twist1基因的seqid?no.1序列、onecut2基因的seq?id?no.2序列中由cg指示的甲基化位點(diǎn)的組合，或者可以?xún)H包括twist1基因的seq?id?no.1序列、vim基因的seq?id?no.3序列中由cg指示的甲基化位點(diǎn)的組合，或者可以?xún)H包括twist1基因的seq?id?no.1序列、cdo1基因的seq?id?no.4序列中由cg指示的甲基化位點(diǎn)的組合，或者僅包括onecut2基因的seq?id?no.2序列、vim基因的seq?id?no.3序列中由cg指示的甲基化位點(diǎn)的組合，或者僅包括onecut2基因的seq?idno.2序列、cdo1基因的seq?id?no.4序列中由cg指示的甲基化位點(diǎn)的組合，或者僅包括vim基因的seq?id?no.3序列、cdo1基因的seq?id?no.4序列中由cg指示的甲基化位點(diǎn)的組合，或者僅包括twist1基因的seq?id?no.1序列、onecut2基因的seq?id?no.2序列、vim基因的seq?id?no.3序列中由cg指示的甲基化位點(diǎn)的組合，或者僅包括twist1基因的seq?id?no.1序列、onecut2基因的seq?id?no.2序列、cdo1基因的seq?id?no.4序列中由cg指示的甲基化位點(diǎn)的組合，或者僅包括onecut2基因的seq?id?no.2序列、vim基因的seq?id?no.3序列、cdo1基因的seq?id?no.4序列中由cg指示的甲基化位點(diǎn)的組合，或者同時(shí)包括twist1基因的seq?id?no.1序列、onecut2基因的seq?id?no.2序列、vim基因的seq?id?no.3序列和cdo1基因的seq?id?no.4序列中由cg指示的甲基化位點(diǎn)的組合。

4、本發(fā)明中，發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用上述dna甲基化生物標(biāo)志物中的至少兩種進(jìn)行膀胱癌甲基化檢測(cè)時(shí)，具有明顯提高的靈敏度和特異性。

5、在一些實(shí)施方案中，dna甲基化生物標(biāo)志物組合包括twist1基因的seqid?no.1序列、onecut2基因的seq?id?no.2序列、vim基因的seq?id?no.3序列和cdo1基因的seq?idno.4序列中由cg指示的甲基化位點(diǎn)的組合。

6、本發(fā)明中，發(fā)明人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用上述dna甲基化生物標(biāo)志物中的四種進(jìn)行膀胱癌甲基化檢測(cè)時(shí)，具有顯著提高的靈敏度和特異性。

7、在第二方面，本發(fā)明提供了上述用于膀胱癌檢測(cè)的dna甲基化生物標(biāo)志物組合在制備用于膀胱癌檢測(cè)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

8、在第三方面，本發(fā)明提供了一種用于膀胱癌檢測(cè)的試劑盒，包括檢測(cè)上述dna甲基化生物標(biāo)志物組合的甲基化水平的試劑。

9、在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包括針對(duì)twist1基因的引物和探針、針對(duì)onecut2基因的引物和探針、針對(duì)vim基因的引物和探針和針對(duì)cdo1基因的引物和探針。

10、在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針的兩端分別連接有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)。

11、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，熒光基團(tuán)包括fam，猝滅基團(tuán)包括mgb。

12、在一些實(shí)施方案中，針對(duì)twist1基因的引物的核苷酸序列如seq?idno.5-6所示，探針的核苷酸序列如seq?id?no.7所示；針對(duì)onecut2基因的引物的核苷酸序列如seq?idno.8-9所示，探針的核苷酸序列如seq?idno.10所示；針對(duì)vim基因的引物的核苷酸序列如seq?id?no.11-12所示，探針的核苷酸序列如seq?id?no.13所示；針對(duì)cdo1基因的引物的核苷酸序列如seq?id?no.14-15所示，探針的核苷酸序列如seq?id?no.16所示。

13、在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包括針對(duì)內(nèi)參基因的引物和探針，內(nèi)參基因包括actb基因。

14、在一些實(shí)施方案中，針對(duì)內(nèi)參基因的引物的核苷酸序列如seq?idno.17-18所示，探針的核苷酸序列如seq?id?no.19所示。

15、在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針的兩端分別連接有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)。

16、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，熒光基團(tuán)包括vic，猝滅基團(tuán)包括mgb。

17、在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包括核酸提取試劑、甲基化轉(zhuǎn)化試劑、pcr反應(yīng)試劑中的至少一種。

18、在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，甲基化轉(zhuǎn)化試劑包括重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑。

19、本發(fā)明中，在進(jìn)行甲基化處理過(guò)程中，重亞硫酸鹽能夠?qū)⑺形窗l(fā)生甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不發(fā)生改變。具體來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)處理后，靶基因序列中沒(méi)有發(fā)生甲基化的c變?yōu)閡，后續(xù)在進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)過(guò)程中，引物探針特異性地捕獲結(jié)合發(fā)生甲基化的c位點(diǎn)發(fā)出熒光，而未發(fā)生甲基化的靶基因無(wú)法與引物探針結(jié)合，不發(fā)出熒光。

20、在一些實(shí)施方案中，試劑盒檢測(cè)的樣本包括尿液樣本。

21、本發(fā)明的有益效果是：區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明首次報(bào)道了同時(shí)檢測(cè)twist1基因、onecut2基因、vim基因和cdo1基因的甲基化水平進(jìn)行膀胱癌的輔助診斷，膀胱癌尿液檢測(cè)結(jié)果顯示靈敏度為95.4％，特異性為97.3％，本發(fā)明提供了一種無(wú)創(chuàng)的、可靠的膀胱癌檢測(cè)方法，在膀胱癌早期篩查中具有較好的應(yīng)用前景。