本發(fā)明屬于生物，具體涉及豬繁殖與呼吸綜合征病毒nsp12蛋白的抗原表位、單克隆抗體及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬繁殖和呼吸綜合征(prrs)是由豬繁殖和呼吸綜合征病毒(prrsv)引起豬的一種重要傳染病。prrsv感染可損害妊娠母豬的生殖系統(tǒng)，導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等，而保育豬和育肥豬感染主要表現(xiàn)咳、喘等呼吸系統(tǒng)疾病，對世界各國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重危害。prrsv是一種具有囊膜的單股正鏈rna病毒，屬于nidovirales目，動脈病毒科的動脈炎病毒屬成員?；蚪M的全長約為15kb，在mrna加工過程中，其5'末端形成帽狀結(jié)構(gòu)，在3'末端有poly-a尾部結(jié)構(gòu)。prrsv基因組包含10個已知的開放閱讀框(orf1a，orf1b，orf2a，orf2b，orf3，orf4，orf5a和orf5-orf7)，其中，orf1a和orf1b編碼兩個大的多蛋白pp1a和pp1ab，這兩個多蛋白最終被orf1a編碼的4四種蛋白酶加工成至少14種與基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白。在這些非結(jié)構(gòu)蛋白中，位于orf1b編碼多蛋白c末端的nsp12是動脈病毒所特有的蛋白，但在prrsv編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白中nsp12的具體結(jié)構(gòu)和功能目前仍然不十分清楚。最近有研究發(fā)現(xiàn)nsp12是一種膜相關(guān)蛋白，也是連接prrsv其他nsps的相互作用的樞紐，推測nsp12可能是復(fù)制和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(rtc)的主要成分。同時，通過prrsv反向基因操作技術(shù)，研究證實(shí)nsp12參與正鏈和負(fù)鏈亞基因組mrna的合成，但不參與基因組rna的合成，表明nsp12對prrsv復(fù)制至關(guān)重要。由于prrsv感染會導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平顯著升高，因此有研究表明nsp12可能是誘導(dǎo)pstat1-s727升高以及il-1β和il-8的表達(dá)的原因。推測nsp12可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)參與prrsv的發(fā)病機(jī)制。但是目前關(guān)于prrsvnsp12生物學(xué)作用的相關(guān)報(bào)道有限，其蛋白特性和抗原性尚不清楚，還需要通過更多的研究來解析nsp12在prrsv感染中的確切功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本研究利用表達(dá)的nsp12蛋白為抗原，制備了5株特異性單克隆抗體，并鑒定其抗原表位，為prrsv的診斷方法開發(fā)提供有效工具。

2、具體的，本發(fā)明提供一種prrsv編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白中nsp12蛋白的三個抗原表位，其特征在于所述的三個抗原表位分別為：93twgfesdtay102、115edyndafrarq124和142pgpvieptl150；

3、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供能夠編碼上述抗原表位的核酸，所述核酸為能夠編碼上述prrsv編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白中nsp12蛋白的三個抗原表位的基因序列；

4、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體攜帶上述核酸。

5、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了一種重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞含有上述的重組表達(dá)載體，或者在基因組中整合有上述的核酸。

6、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白是由上述的nsp12蛋白的三個抗原表位中的任選的一個或多個的重復(fù)或者組合，或者上述重復(fù)或者組合與載體蛋白或其他抗原表位蛋白融合所形成。

7、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了一種特異性識別上述nsp12蛋白的抗原表位的單克隆抗體。

8、優(yōu)選的，所述單克隆抗體分別為：單克隆抗體3g11，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如seq?id?no.3所示(evqlqesgaelvkpgasvklsckasgytftsyymfwvkqrpgqglewigeinpsnggtnfnerfkskatltvdkssst?acmqvsgvasedcavyyctrv)，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如seq?id?no.4所示(slgervtitckasqdinnylgwfqqnpgkspktliyrsnrlvdgvpsrfsgsgsgqdysltissleyedmgiyyclqy?defpptfgagtklglkr)；

9、單克隆抗體2e3，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如seq?id?no.5所示(slsspstvtgysitsdyawnwirqfpgnklewmgyisysgstsynpslksrisitrdtsknqfflqlnsvttedtatyycareisllrlyyfdywgqgttvtvss)，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如seq?id?no.6所示(wnqqkpgqpprlliylvsnlqsgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpsws)；

10、單克隆抗體10g6其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如seq?id?no.7所示(evqlkesgaelvkpgasvklsckasgytftsyymfwvkqrpgqglewigeinpsnggtnfnerfkskatltvdkssst?aymqlsgltsedsavyyctrdlfaywgqgtmvtvss)，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如seq?id?no.8所示(wnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqh)。

11、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了上述nsp12蛋白的三個抗原表位，和/或單克隆抗體在制備檢測prrsv感染或檢測prrsv抗體的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

12、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了上述nsp12蛋白的三個抗原表位，和/或單克隆抗體在制備防治prrsv感染的藥物或疫苗中的應(yīng)用。

13、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了上述nsp12蛋白的三個抗原表位在制備prrsv抗體中的應(yīng)用。

14、有益效果

15、在本研究中，我們制備了5株抗nsp12蛋白的單克隆抗體，這些單抗都與nsp12蛋白具有良好的反應(yīng)性。隨后，我們鑒定出5株單抗能夠識別nsp12蛋白中的三個抗原表位(93twgfesdtay102、114edyndafrar123和142pgpvieptl150)。結(jié)果驗(yàn)證，屬于保守性抗原表位，靶向這些抗原表位中的所有單抗都可以識別prrsv-2毒株的nsp12蛋白，表明針對上述三個抗原表位的單抗具有作為區(qū)分prrsv-1和prrsv-2毒株的鑒別診斷的潛力，總之，本研究為基于抗原表位的prrsv檢測提供了新的選擇靶點(diǎn)。

16、進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一株新的針對抗nsp12蛋白的單克隆抗體的具體序列，其中，所述單克隆抗體3g11的可變區(qū)序列中，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為：序列seq?id?no.3所示的氨基酸序列，或序列seq?id?no.3經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾獲得的保守性變異體；輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為：序列seq?id?no.4所示的氨基酸序列，或序列seqid?no.4經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾獲得的保守性變異體；

17、其中，所述單克隆抗體2e3的可變區(qū)序列中，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為：序列seqid?no.5所示的氨基酸序列，或序列seq?id?no.5經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾獲得的保守性變異體；輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為：序列seq?id?no.6所示的氨基酸序列，或序列seq?id?no.6經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾獲得的保守性變異體；

18、其中，所述單克隆抗體10g6的可變區(qū)序列中，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為：序列seqid?no.7所示的氨基酸序列，或序列seq?id?no.7經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾獲得的保守性變異體；輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為：序列seq?id?no.8所示的氨基酸序列，或序列seq?id?no.8經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾獲得的保守性變異體；

19、利用上述抗體可以實(shí)現(xiàn)對現(xiàn)有prrsv病毒無法準(zhǔn)確定量、預(yù)期表達(dá)效果無法驗(yàn)證的技術(shù)難題，解決了配制疫苗的關(guān)鍵問題。同時，含所述抗體的藥物組合物，可以不分種屬地預(yù)防和/或治療豬源所引發(fā)的prrsv疾病，不僅可解決prrsv經(jīng)典株導(dǎo)致的豬繁殖和呼吸綜合征還可解決豬繁殖和呼吸綜合征病毒變異株導(dǎo)致的豬繁殖和呼吸綜合征，具有廣譜性；彌補(bǔ)無商品化疫苗的缺憾，可用于緊急預(yù)防和/或治療，減少了發(fā)病率、降低了死亡率。