本發(fā)明涉及化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域。具體涉及一類基于krasg12d多肽抑制劑設(shè)計(jì)的熒光偏振探針在測(cè)定化合物對(duì)krasg12d蛋白的抑制活性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、ras是人類癌癥中最常發(fā)生突變的癌基因，在所有癌癥中約有30％發(fā)生突變。1982年，三家實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了首個(gè)確認(rèn)的人類致癌基因ras，并且克隆了三種變體：kras，hras和nras，其中kras是最常突變的致癌基因，出現(xiàn)在大約四分之一的人類腫瘤中。其在肺癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌中的突變率分別約為30％、90％和40％，并且與預(yù)后不良相關(guān)。以肺癌為例，85％的kras突變?yōu)間12突變。其中，g12c、g12v、g12d突變分別約占46％、23％、17％(j.med.chem.2020,63(23),14404-14424)。

2、目前對(duì)kras?g12c突變型的研究已經(jīng)取得了一定的成果，但人們很快意識(shí)到靶向突變kras并不像最初想象的那樣簡(jiǎn)單。首先，sotorasib是krasg12c的特異性抑制劑，而g12c只是眾多kras突變型中的一種。另一種常見(jiàn)的突變，如g12d，在大多數(shù)胰腺腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。相比于研究較多的karsg12c突變型，對(duì)于g12d突變型的研究相對(duì)較少。但是g12d在多種腫瘤中突變的頻率也非常高，在胰腺癌，大腸癌，膽道癌中突變頻率分別高達(dá)49％，35％，48％，是治療實(shí)體瘤的潛在靶點(diǎn)。此外，包括kras、hras和nras的mapk通路具有不同的重復(fù)信號(hào)和反饋機(jī)制，這些機(jī)制使人體極易產(chǎn)生對(duì)藥物的耐藥性。在臨床試驗(yàn)中，sotorasib和adagasib的緩解率均不超過(guò)30-40％，無(wú)進(jìn)展生存期(pfs)中位數(shù)改善約6個(gè)月。對(duì)于靶向突變的特異性治療來(lái)說(shuō)，這不是一個(gè)理想的數(shù)據(jù)，也不如其他靶向藥物(如egfr和alk抑制劑)觀察到的結(jié)果。

3、目前最具代表性的krasg12d抑制劑為mrtx-1133目前正處于臨床二期研究中。mrtx1133是一種非共價(jià)、強(qiáng)效和選擇性krasg12d抑制劑。它可以阻止sos1催化的核苷酸交換和krasg12d/gtp/raf1復(fù)合物的形成，從而抑制突變體kras依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。mrtx1133在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中具有個(gè)位數(shù)納摩爾活性，在含有krasg12d突變的腫瘤模型中具有顯著的體內(nèi)療效，并且具有良好的選擇性對(duì)g12d的選擇性在野生型的500倍以上(j.med.chem.2021,65(4),3123-3133)。

4、因此開(kāi)發(fā)體外krasg12d抑制活性測(cè)試方法以及高通量篩選方法對(duì)其小分子抑制劑的發(fā)展至關(guān)重要。準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠的活性測(cè)試方法有助于發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的先導(dǎo)化合物，指導(dǎo)先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化以獲得活性更優(yōu)的候選藥物分子，為靶向krasg12d的肺癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌等疾病的治療藥物的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

5、目前針對(duì)krasg12d使用最多的體外靶標(biāo)活性測(cè)試方法為htrf(均相時(shí)間分辨熒光)是用來(lái)檢測(cè)均相體系中待測(cè)物的一種最常用的方法，是用來(lái)研究藥物靶標(biāo)的理想的平臺(tái)j.med.chem.2021,65(4),3123-3133)。這種技術(shù)結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)和時(shí)間分辨技術(shù)(tr)。在tr-fret實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)供體和受體相離很近時(shí)，在供體和受體之間會(huì)有熒光共振能量轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生信號(hào)。采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)能夠顯著減小緩沖液和培養(yǎng)基的干擾，最終的信號(hào)跟產(chǎn)物形成的量成比例。雖然該技術(shù)有著靈敏度高，信號(hào)穩(wěn)定，可以用于高通量篩選等優(yōu)點(diǎn)，但是其測(cè)試體系和操作流程較為復(fù)雜，并且測(cè)試成本較高。

6、熒光偏振(fp)檢測(cè)技術(shù)是一種以熒光標(biāo)記的檢測(cè)技術(shù)，它把熒光物質(zhì)標(biāo)記在特定物質(zhì)上，使原本微弱的反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)化成較強(qiáng)的熒光信號(hào)，起到信號(hào)增強(qiáng)的作用。溶液中的大分子(如蛋白質(zhì))因體積較大旋轉(zhuǎn)相對(duì)較慢，在被偏振光激發(fā)時(shí)發(fā)出偏振光；而小分子的快速旋轉(zhuǎn)將導(dǎo)致信號(hào)消偏。發(fā)射系統(tǒng)使用偏振濾光片分析發(fā)射光的偏振水平，偏振水平低表明熒光小分子在樣品中自由移動(dòng)。偏振水平高表明熒光分子附著在較大的分子復(fù)合物上(j.med.chem.2023,66(16),10934-10958)。

7、為了突破目前krasg12d抑制活性測(cè)試方法的局限性，本申請(qǐng)采用報(bào)道的小分子抑制劑骨架作為krasg12d蛋白的結(jié)合片段，通過(guò)進(jìn)一步引入連接鏈以及熒光基團(tuán)，設(shè)計(jì)并合成了一種基于krasg12d抑制劑設(shè)計(jì)的小分子熒光探針。基于該類小分子熒光探針建立熒光偏振的活性測(cè)定方法相較于htrf，測(cè)試體系簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜的緩沖液體系，受時(shí)間、溶劑影響小等優(yōu)勢(shì)，可用于krasg12d抑制劑的篩選。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提出一種基于具有krasg12d蛋白親和力的多肽熒光探針。該類探針?lè)肿涌捎糜谘芯?、探索krasg12d蛋白配體在體內(nèi)的作用特征及與其靶點(diǎn)的作用模式、活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)信息，可應(yīng)用于測(cè)定化合物對(duì)krasg12d蛋白的親和力。本發(fā)明的第二目的是提供一種多肽熒光探針的應(yīng)用。本發(fā)明的第三目的是提供一種krasg12d蛋白配體篩選的方法。本發(fā)明的第三目的是提供一種試劑盒。

2、技術(shù)方案：本發(fā)明的熒光探針?lè)肿?，具有如下結(jié)構(gòu)：

3、

4、另一方面，本發(fā)明提供一種上述多肽熒光探針在krasg12d蛋白小分子配體篩選方面的應(yīng)用。

5、所述化合物作為熒光偏振探針在krasg12d蛋白抑制劑篩選中的應(yīng)用。

6、另一方面，本發(fā)明提供一種krasg12d蛋白配體篩選的方法，包括如下步驟：

7、(1)將多肽熒光探針、krasg12d蛋白和待測(cè)化合物溶于緩沖液后混合得混合物；(2)利用熒光偏振酶標(biāo)儀測(cè)定混合物在多肽熒光探針?biāo)璧奶囟úㄩL(zhǎng)下的偏振值，根據(jù)偏振值確認(rèn)待測(cè)化合物對(duì)krasg12d蛋白的親和力。

8、進(jìn)一步的，步驟(1)中，所述的緩沖液包括pbs緩沖液、tris緩沖液及hepes緩沖液。

9、進(jìn)一步的，步驟(1)中，krasg12d蛋白和探針?lè)跤龝r(shí)間為0.5h-1h。

10、進(jìn)一步的，步驟(1)中，多肽熒光探針在緩沖液中的濃度為5-20nm。

11、進(jìn)一步的，步驟(2)中，所需的波長(zhǎng)中，激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535nm。

12、另一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，所述試劑盒包括上的多肽熒光探針。

13、為了突破目前krasg12d抑制活性測(cè)試方法的局限性，本申請(qǐng)采用報(bào)道的多肽作為krasg12d蛋白的結(jié)合片段，通過(guò)進(jìn)一步引入熒光片段，設(shè)計(jì)并合成了一類基于krasg12d抑制劑設(shè)計(jì)的多肽熒光偏振探針，基于熒光偏振原理建立了一種穩(wěn)定，快速以及廉價(jià)的體外krasg12d蛋白抑制活性檢測(cè)方法。同時(shí)通過(guò)測(cè)試已報(bào)道的小分子酶親和活力，驗(yàn)證了此方法的適用性和準(zhǔn)確性。

14、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)：基于該類多肽熒光偏振探針建立的活性測(cè)定方法，測(cè)試體系簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜的緩沖液體系，受時(shí)間、溶劑影響小等優(yōu)勢(shì)，可用于krasg12d抑制劑的篩選。

技術(shù)特征：

1.一種多肽熒光探針，其特征在于，多肽熒光探針具有如下結(jié)構(gòu)：

2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述化合物作為熒光偏振探針在krasg12d蛋白抑制劑篩選中的應(yīng)用。

3.一種krasg12d蛋白配體篩選的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)將權(quán)利要求1所述的多肽熒光探針、krasg12d蛋白和待測(cè)化合物溶于緩沖液后混合并孵育時(shí)間；(2)利用熒光偏振酶標(biāo)儀測(cè)定混合物在多肽熒光探針?biāo)璧牟ㄩL(zhǎng)下的偏振值，根據(jù)偏振值確認(rèn)待測(cè)化合物對(duì)krasg12d蛋白的親和力。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的krasg12d蛋白配體篩選的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的緩沖液包括pbs緩沖液、tris緩沖液及hepes緩沖液。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的krasg12d蛋白配體篩選的方法，其特征在于，步驟(1)中，krasg12d蛋白和探針?lè)跤龝r(shí)間為0.5h-1h。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的krasg12d蛋白配體篩選的方法，其特征在于，步驟(1)中，多肽熒光探針在緩沖液中的濃度為5-20nm。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的krasg12d蛋白配體篩選的方法，其特征在于，步驟(2)中，所需的波長(zhǎng)中，激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535nm。

8.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的多肽熒光探針。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種KRAS<supgt;G12D</supgt;多肽熒光探針及應(yīng)用，多肽熒光探針具有如下所示的結(jié)構(gòu)。基于該類多肽熒光偏振探針建立的活性測(cè)定方法，測(cè)試體系簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜的緩沖液體系，受時(shí)間、溶劑影響小等優(yōu)勢(shì)，可用于KRAS<supgt;G12D</supgt;抑制劑的篩選。

技術(shù)研發(fā)人員：張曉進(jìn),楊樂(lè),李宇航,邴天德,伍悅,李翛然
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)藥科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21