本發(fā)明涉及一種d-蘇氨酸醛縮酶，尤其涉及一種高立體選擇性的d-蘇氨酸醛縮酶突變體及其應(yīng)用，屬于酶工程和化學(xué)工程。

背景技術(shù)：

1、通過形成碳碳鍵(c-c)，作為生物催化劑的縮酶能夠?qū)⑻脊羌苎娱L，形成更大的分子，而酶促醛醇加成反應(yīng)可在綠色條件下生成許多高價(jià)值化合物，因此在自然界的有機(jī)物循環(huán)中起關(guān)鍵作用。蘇氨酸醛縮酶(threonine?aldolase，ta)，包括d-蘇氨酸醛縮酶(dta)和l-蘇氨酸醛縮酶，能夠在磷酸吡哆醛的輔助下催化不同類型的醛與氨基酸縮合形成β-羥基-α-氨基酸，為活性藥物成分、抗生素或農(nóng)用化學(xué)品構(gòu)件等各種高價(jià)值化合物提供了多功能催化平臺(tái)。β-羥基-α-氨基酸含有雙手性中心(cα和cβ)，而目前已報(bào)道的ta同時(shí)生成非對(duì)映異構(gòu)體threo-β-羥基-α-氨基酸和erythro-β-羥基-α-氨基酸，即在cα具有高度立體選擇性，但普遍不能嚴(yán)格控制cβ立體選擇性，導(dǎo)致產(chǎn)物的非對(duì)映體過量值(diastereomericexcess，de)較低。有報(bào)道使用來自a.xylosoxidans來源的d-low-ta，能實(shí)現(xiàn)以4-甲砜基苯甲醛的催化反應(yīng)的產(chǎn)率提升，但未提及cβ位點(diǎn)的非對(duì)映選擇性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種在制備d-thero對(duì)甲砜基苯絲氨酸時(shí)具備更高活性和更高立體選擇性的d-蘇氨酸醛縮酶突變體及其應(yīng)用。

2、技術(shù)方案：本發(fā)明的第一方面提供一種高立體選擇性的d-蘇氨酸醛縮酶突變體，所述d-蘇氨酸醛縮酶突變體的氨基酸序列由如seq?id?no:1所示序列經(jīng)突變得到，所述突變包括：第146位天冬酰胺變?yōu)楦拾彼?、賴氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺中的任意一種，和/或第147位精氨酸突變?yōu)楸奖彼?、酪氨酸中的任意一種，和/或第148位半胱氨酸突變?yōu)楸奖彼?，?或第177位酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?、組氨酸、色氨酸中的任意一種，和/或第312位絲氨酸突變?yōu)楸彼帷⒘涟彼?、蘇氨酸中的任意一種。

3、優(yōu)選s312a、y177f/s312a、r147f/y177f/s312a、c148f/r147f/y177f/s312a、n146g/r147f/y177f/s312a、n146k/r147f/y177f/s312a中的任意一種。

4、本發(fā)明利用公開的d-蘇氨酸醛縮酶的序列和結(jié)構(gòu)信息，通過在ncbi等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行非冗余性檢索，根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)相似性、保守位點(diǎn)分析和宿主來源多樣性等原則，篩選出潛在的酶基因；將這些基因進(jìn)行功能表達(dá)、純化，得到純凈的酶。優(yōu)選的d-蘇氨酸醛縮酶(seqid?no:1，ncbi登錄號(hào)wp_046479359.1)源自海洋單胞菌filomicrobiummarinum，其具備廣泛的底物適用性，能夠催化多種醛和α氨基酸底物生成對(duì)應(yīng)的β-羥基-α-氨基酸化合物。本發(fā)明通過擴(kuò)增該酶基因(seq?id?no:2)，并運(yùn)用理性設(shè)計(jì)對(duì)其進(jìn)行定向進(jìn)化改造，最終獲得了多種對(duì)d-threo對(duì)甲砜基苯絲氨酸的非對(duì)映選擇性顯著提高的蘇氨酸醛縮酶突變體。

5、在本文的所有討論中，使用針對(duì)氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母代碼，以及標(biāo)準(zhǔn)的取代記法。例如，s312a意指n端處第312位的絲氨酸(s)突變?yōu)楸彼?a)；y177f/s312a意指n端處第177位的酪氨酸(y)突變?yōu)楸奖彼?f)，并且n端處第312位的絲氨酸(s)突變?yōu)楸彼?a)。

6、本發(fā)明的第二方面提供一種核酸分子，所述核酸分子編碼如第一方面所述的d-蘇氨酸醛縮酶突變體，所述核酸分子的核苷酸序列由如seq?id?no:2所示序列經(jīng)堿基突變得到。

7、本發(fā)明的第三方面提供一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含如第二方面所述的核苷酸序列，所述表達(dá)載體可以為pet系列表達(dá)載體。

8、本發(fā)明的第四方面提供一種重組細(xì)胞及其構(gòu)建方法，所述重組細(xì)胞包含如第三方面所述的表達(dá)載體，所述重組細(xì)胞可以為大腸桿菌。所述重組細(xì)胞的構(gòu)建方法包括如下步驟：

9、(1)構(gòu)建表達(dá)載體：將如第二方面所述的核酸分子與質(zhì)粒連接，得到如第三方面所述的表達(dá)載體；

10、(2)構(gòu)建重組細(xì)胞：將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)并篩選得到重組細(xì)胞。

11、本發(fā)明的第五方面提供一種產(chǎn)品及其應(yīng)用，所述產(chǎn)品包含如第一方面所述的d-蘇氨酸醛縮酶突變體，或如第二方面所述的核酸分子，或如第三方面所述的表達(dá)載體，或如第四方面所述的重組細(xì)胞。所述產(chǎn)品包括催化劑。

12、所述應(yīng)用包括合成d-thero對(duì)甲砜基苯絲氨酸，如催化醛和甘氨酸合成手性d-thero對(duì)甲砜基苯絲氨酸。

13、所述應(yīng)用的反應(yīng)條件包括在溫度為25～45℃，ph為5.5～10.0的條件下反應(yīng)10～20h。所述應(yīng)用的反應(yīng)條件包括添加不超過總體積20％的有機(jī)溶劑。所述有機(jī)溶劑可選dmso。

14、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明提供的所述突變體，具有較高的cβ立體選擇性和產(chǎn)率；2、本發(fā)明提供了一種制備d-thero對(duì)甲砜基苯絲氨酸的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包含具有較高的cβ立體選擇性和產(chǎn)率的d-蘇氨酸醛縮酶突變體或其編碼基因或相應(yīng)表達(dá)載體或相應(yīng)重組細(xì)胞；3、本發(fā)明提供了一種d-蘇氨酸醛縮酶突變體的構(gòu)建及其應(yīng)用方法，所述應(yīng)用的反應(yīng)條件溫和、易于實(shí)現(xiàn)，在醫(yī)藥化工領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種高立體選擇性的d-蘇氨酸醛縮酶突變體，其特征在于，所述d-蘇氨酸醛縮酶突變體的氨基酸序列由如seq?id?no:1所示序列經(jīng)突變得到，所述突變包括：第146位天冬酰胺變?yōu)楦拾彼?、賴氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺中的任意一種，和/或第147位精氨酸突變?yōu)楸奖彼?、酪氨酸中的任意一種，和/或第148位半胱氨酸突變?yōu)楸奖彼?，?或第177位酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?、組氨酸、色氨酸中的任意一種，和/或第312位絲氨酸突變?yōu)楸彼?、亮氨酸、蘇氨酸中的任意一種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的d-蘇氨酸醛縮酶突變體，其特征在于，所述突變體為s312a、y177f/s312a、r147f/y177f/s312a、c148f/r147f/y177f/s312a、n146g/r147f/y177f/s312a、n146k/r147f/y177f/s312a中的任意一種。

3.一種核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼權(quán)利要求1所述的d-蘇氨酸醛縮酶突變體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列由如seqid?no:2所示序列經(jīng)堿基突變得到。

5.一種表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體包含權(quán)利要求4所述的核苷酸序列。

6.一種重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞包含權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體。

7.一種權(quán)利要求6所述重組細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

8.一種產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包含權(quán)利要求1所述的d-蘇氨酸醛縮酶突變體，或權(quán)利要求3～4任一項(xiàng)所述的核酸分子，或權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，或權(quán)利要求6所述的重組細(xì)胞。

9.一種權(quán)利要求8所述產(chǎn)品在合成d-thero對(duì)甲砜基苯絲氨酸中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用的反應(yīng)條件包括在溫度為25～45?℃，ph為5.5～10.0的條件下反應(yīng)10~20?h。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種高立體選擇性的D?蘇氨酸醛縮酶突變體及其應(yīng)用，所述突變體由野生型D?蘇氨酸醛縮酶定向進(jìn)化得到，包括第146位天冬酰胺變?yōu)楦拾彼?、賴氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺中的任意一種，和/或第147位精氨酸突變?yōu)楸奖彼帷⒗野彼嶂械娜我庖环N，和/或第148位半胱氨酸突變?yōu)楸奖彼?，?或第177位酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?、組氨酸、色氨酸中的任意一種，和/或第312位絲氨酸突變?yōu)楸彼?、亮氨酸、蘇氨酸中的任意一種。本發(fā)明提供的D?蘇氨酸醛縮酶突變體在合成D?thero對(duì)甲砜基苯絲氨酸時(shí)具有較高的C<subgt;β</subgt;立體選擇性和產(chǎn)率；應(yīng)用所述突變體的反應(yīng)條件溫和、易于實(shí)現(xiàn)，在醫(yī)藥化工領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：任鑫坤,曹家南,王騫,余克洋,范鑫龍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21