本發(fā)明屬于生物化學(xué)，涉及一類具有非天然氨基酸的低毒廣譜抗菌肽及其應(yīng)用，本發(fā)明同時(shí)還涉及該抗菌肽在制備臨床抗菌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、近幾十年來，抗生素的過度使用導(dǎo)致了微生物耐藥性的出現(xiàn)，從而給公共衛(wèi)生帶來了前所未有的危機(jī)(nature?medicine,2018,24,1097-1103.)。根據(jù)美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心(centers?for?disease?control?and?prevention)的最新調(diào)查，細(xì)菌是危及生命的感染(如肺部和傷口感染)的罪魁禍?zhǔn)?，這些感染因長(zhǎng)期治療而帶來巨大的社會(huì)成本和醫(yī)療系統(tǒng)負(fù)擔(dān)(jama,2013,310(16),1661-1663.)。

2、細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)是一個(gè)全球性問題，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。大多數(shù)抗生素通過干擾細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)和核酸的合成或代謝來殺死細(xì)菌。然而，細(xì)菌可以通過改變其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或進(jìn)化溶菌酶等酶來輕易地產(chǎn)生耐藥性以應(yīng)對(duì)抗生素(international?journal?ofmolecular?sciences,2023,24(6),5777.)?？咕?amps)是自然界中各種有機(jī)體固有免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一類生物分子。由于它們能夠與帶負(fù)電荷的脂質(zhì)結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌膜滲透。此外，許多研究結(jié)果表明，amps還具有靶向內(nèi)部作用目標(biāo)的能力(antibiotics,2024,13(3),202.)。在這種情況下，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡可能涉及與dna/rna相互作用，在細(xì)胞內(nèi)對(duì)蛋白質(zhì)合成和酶活性產(chǎn)生不利影響或抑制形成細(xì)胞壁/膜。因此，開發(fā)新型抗生素已經(jīng)變得至關(guān)重要，并且抗菌肽代表了一類具有巨大潛力的新型抗生素。

3、天然抗菌肽由于具有代謝不穩(wěn)定性、生產(chǎn)成本高、容易引起溶血副作用等缺點(diǎn)限制了它們的進(jìn)一步臨床應(yīng)用。此外，最近有越來越多的觀點(diǎn)認(rèn)為，臨床使用序列與人類amps過于接近的天然抗菌肽將不可避免地?fù)p害自身的自然防御，可能對(duì)公眾健康構(gòu)成威脅(science,2020,1；368(6490):eaau5480)。在這種觀點(diǎn)下，非天然(或合成)肽被開發(fā)出來，以提供更廣泛的amps武器庫(kù)。在此基礎(chǔ)上，申請(qǐng)人將非天然氨基酸引入抗菌肽基序gxxyyxxyyi-nh2，研究設(shè)計(jì)具有抗菌譜廣且低毒性、高穩(wěn)定性的抗菌肽，在制備臨床抗菌藥物方面有很好的應(yīng)用前景，有希望成為新型抗生素的候選藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是提供一類具有非天然氨基酸的低毒廣譜抗菌肽。

2、本發(fā)明的目的之二是提供上述抗菌肽在制備臨床抗菌藥物中的應(yīng)用。

3、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

4、一、具有非天然氨基酸的低毒廣譜抗菌肽的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

5、本發(fā)明具有非天然氨基酸的低毒廣譜抗菌肽，是以gxxyyxxyyi-nh2為模板，對(duì)xxyy氨基酸序列重復(fù)兩次，并將c端酰胺化得到，記作xy；

6、其中，x為疏水氨基酸：w(d-色氨酸)、b(l-4,4'-聯(lián)苯基丙氨酸)、n(3-(1-萘基)-l-丙氨酸)或fu(4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸)；y為帶電氨基酸氨酸：o(鳥氨酸)、k(d-賴氨酸)或r(d-精氨酸)；

7、n端g為谷氨酸(gly)，能夠保持一定的穩(wěn)定性，c端i為異亮氨酸(ile)，能夠提供一定的活性；c端酰胺化可保持高的凈正電荷性。

8、具體的，所述抗菌肽為gwwoowwooi-nh2，記作wo；

9、或：gb(l-4,4'-聯(lián)苯基丙氨酸)bo(鳥氨酸)obbooi-nh2，記作bo；

10、或：gn(3-(1-萘基)-l-丙氨酸)no(鳥氨酸)onnooi-nh2，記作no；

11、或：gfu(4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸)fuo(鳥氨酸)ofufuooi-nh2，記作fuo；

12、或：gw(d-色氨酸)wk(d-賴氨酸)kwwkki-nh2，記作wk；

13、或：gb(l-4,4'-聯(lián)苯基丙氨酸)bk(d-賴氨酸)kbbkki-nh2，記作bk；

14、或：gn(3-(1-萘基)-l-丙氨酸)nk(d-賴氨酸)knnkki-nh2，記作nk；

15、或：gfu(4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸)fuk(d-賴氨酸)kfufukki-nh2，記作fuk；

16、或：gw(d-色氨酸)wr(d-精氨酸)rwwrri-nh2，記作wr；

17、或：gb(l-4,4'-聯(lián)苯基丙氨酸)br(d-精氨酸)rbbrri-nh2，記作br；

18、或：gn(3-(1-萘基)-l-丙氨酸)nr(d-精氨酸)rnnrri-nh2，記作nk；

19、或：gfu(4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸)fur(d-精氨酸)rfufurri-nh2，記作fur。

20、優(yōu)選為含氟的fuo、fuk或fur；更優(yōu)選為fuk。

21、上述具有非天然氨基酸的低毒廣譜抗菌肽均采用經(jīng)典固相合成法制備得到。

22、二、具有非天然氨基酸的低毒廣譜抗菌肽在制備臨床抗菌藥物中的應(yīng)用

23、1、體外抑菌實(shí)驗(yàn)

24、采用經(jīng)典微量連續(xù)二倍稀釋法測(cè)定抗菌肽對(duì)革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌)及革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌)的最小抑菌濃度。實(shí)驗(yàn)以抗生素methicillin、polymyxin?b、cephalothin、gentamicin、streptomycin和rifampicin作為陽性對(duì)照，平行重復(fù)3次，結(jié)果見表1。

25、表1本發(fā)明抗菌肽對(duì)常見標(biāo)準(zhǔn)菌株的最低抑菌濃度

26、

27、表1結(jié)果顯示，本發(fā)明抗菌肽對(duì)革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌)及革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌)都具有很強(qiáng)的抑制作用，表現(xiàn)為廣譜抗菌活性，且抗革蘭氏陽性菌的效果優(yōu)于抗生素polymyxin?b。

28、根據(jù)溶血活性圖，擬合并計(jì)算多肽引起10％的小鼠紅細(xì)胞破裂的濃度，記作：hc10。計(jì)算多肽對(duì)所測(cè)試的革蘭氏陽性菌、陰性菌和所有細(xì)菌的mic的幾何平均值，記作：g+，g-和gall，評(píng)估多肽對(duì)革蘭氏陽性菌、陰性菌活性的差異。通過計(jì)算治療指數(shù)ti(ti＝hc10/g，hc10>256μm時(shí)，以512μm進(jìn)行計(jì)算)評(píng)估多肽的安全性。結(jié)果見表2。

29、表2本發(fā)明抗菌肽對(duì)革蘭氏陽性菌/陰性菌的幾何平均值和選擇性指數(shù)

30、

31、

32、表2結(jié)果同樣顯示，本發(fā)明抗菌肽對(duì)革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌都具有很強(qiáng)的抑制作用，表現(xiàn)為廣譜抗菌活性。尤其是含有fu(4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸)的多肽，普遍表現(xiàn)出高活性，其中以抗菌肽fuk活性最佳，以下以抗菌肽fuk為例進(jìn)行溶血活性實(shí)驗(yàn)、lps結(jié)合實(shí)驗(yàn)、誘導(dǎo)耐藥實(shí)驗(yàn)和掃描電鏡實(shí)驗(yàn)。

33、2、溶血活性實(shí)驗(yàn)

34、為了考察本發(fā)明合成的抗菌肽對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性，對(duì)本發(fā)明抗菌肽fuk與小鼠紅細(xì)胞孵育1h后的溶血情況進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖1。

35、圖1結(jié)果顯示，本發(fā)明抗菌肽fuk在發(fā)生10％的溶血時(shí)對(duì)應(yīng)的的濃度均大于256μm，遠(yuǎn)高于所測(cè)其對(duì)五種細(xì)菌的最低抑菌濃度。該結(jié)果說明，本發(fā)明合成的抗菌肽毒性較低，用藥安全。

36、3、lps結(jié)合實(shí)驗(yàn)

37、內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分之一，也是多粘菌素b的靶標(biāo)。因此，申請(qǐng)人設(shè)計(jì)了競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)，通過與不同濃度的內(nèi)毒素孵育來驗(yàn)證抗菌肽fuk是否能作用于內(nèi)毒素，然后測(cè)定其對(duì)肺炎克雷伯菌的殺菌活性，結(jié)果見圖3。

38、圖3結(jié)果顯示，內(nèi)毒素對(duì)抗菌肽fuk和多粘菌素b的抗菌活性有劑量依賴性的抑制作用，fuk和內(nèi)毒素的結(jié)合效率(256μg/ml)比多粘菌素b和內(nèi)毒素(128μg/ml)低2倍，表明fuk可以與內(nèi)毒素相互作用，但結(jié)合率較低。

39、4、誘導(dǎo)耐藥實(shí)驗(yàn)

40、抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素相比，最突出的優(yōu)勢(shì)是難以產(chǎn)生耐藥性。由于其膜溶解作用機(jī)制，細(xì)菌很難改變細(xì)胞膜成分從而產(chǎn)生耐藥。因此，為了研究本發(fā)明抗菌肽是否具有不易產(chǎn)生耐藥性的特質(zhì)，申請(qǐng)人測(cè)定了抗菌肽fuk和抗生素(gentamicin/polymyxin?b)對(duì)金黃色葡萄球菌s.aureus?atcc?25923和肺炎克雷伯菌k.pneumoniae?atcc?700603連續(xù)作用15天的抗菌活性。

41、一般而言，mic在1-4倍范圍內(nèi)波動(dòng)屬于正常情況，若mic大于4倍，表明抗生素已產(chǎn)生耐藥。如圖2所示，傳統(tǒng)抗生素gentamicin對(duì)對(duì)金黃色葡萄球菌s.aureus?atcc?25923連續(xù)作用第7天時(shí)就已產(chǎn)生耐藥，在連續(xù)作用15天后，對(duì)金黃色葡萄球菌的mic已提高了128倍。多肽抗生素polymyxin?b對(duì)肺炎克雷伯菌k.pneumoniae?atcc?700603連續(xù)作用15天的抗菌活性沒有產(chǎn)生明顯的變化。而fuk對(duì)對(duì)金黃色葡萄球菌s.aureus?atcc?25923和肺炎克雷伯菌k.pneumoniae?atcc?700603連續(xù)作用15天的抗菌活性均沒有產(chǎn)生耐藥性，說明多肽抗菌藥物相比傳統(tǒng)抗生素，在耐藥性方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。

42、5、掃描電鏡實(shí)驗(yàn)

43、本實(shí)驗(yàn)中，申請(qǐng)人利用掃描電鏡顯微鏡(sem)來直觀觀察抗菌肽作用后引起的細(xì)菌形態(tài)的改變。具體的實(shí)驗(yàn)方法如下：將生長(zhǎng)過夜的金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌在mh培養(yǎng)基中稀釋為10×108cfu/ml，離心10000rpm×5min，pbs洗兩次，半體積重懸于pbs中，500μl菌液與500μl多肽溶液混合(多肽終濃度為2×mic)，在37℃培養(yǎng)箱中孵育分別孵育30min和2h。時(shí)間到后，樣品離心10000rpm×10min，加入500μl2.5％戊二醛在4℃條件下固定過夜，隨后，pbs洗2遍，用乙醇梯度洗脫(乙醇濃度依次為50％、70％、80％、90％和100％)，加入乙醇靜置10min后離心。乙醇梯度洗脫后，加入150μl叔丁醇室溫放置2h，離心后將細(xì)菌沉淀置于圓形載玻片。樣品干燥，噴金，使用apreo?s掃描電鏡(thermo?fisherscientific,ma,usa)進(jìn)行分析。

44、由圖5可觀察到，正常的和金黃色葡萄球菌表面光滑完整，但與抗菌肽fuk和polymyxin?b作用30min后，肺炎克雷伯菌開始出現(xiàn)表面皺縮，細(xì)胞內(nèi)容物泄露，喪失了完整的細(xì)胞形態(tài)，抗菌肽的效果好于polymyxin?b。而金黃色葡萄球菌與抗菌肽fuk和vancomycin作用30min后，主要呈現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞壁產(chǎn)生小泡，并且隨著抗菌肽作用時(shí)間的延長(zhǎng)，造成了更大規(guī)模的細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)的改變。掃描電鏡結(jié)果很明顯的觀察到本發(fā)明的抗菌肽對(duì)肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌的膜破壞能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于polymyxin?b和vancomycin。

45、本發(fā)明的有益效果在于：

46、1、本發(fā)明將非天然氨基酸引入抗菌肽基序gxxyyxxyyi，其中，x是疏水氨基酸：w(d-色氨酸)，b(l-4,4'-聯(lián)苯基丙氨酸)，n(3-(1-萘基)-l-丙氨酸)，fu(4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸)；y為帶電氨基酸氨酸：o(鳥氨酸)，k(d-賴氨酸)，r(d-精氨酸)；n端的g為谷氨酸(gly)，能夠保持一定的穩(wěn)定性，c端的i為(ile)，能夠提供一定的活性。其抗菌試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)和誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)表明所述抗菌肽具有抗菌譜廣且低毒性的優(yōu)勢(shì)、安全性較高。誘導(dǎo)耐藥實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的抗菌肽均具有低耐藥發(fā)生性特點(diǎn)，在制備臨床抗菌藥物方面有很好的應(yīng)用前景，有希望成為新型抗生素的候選藥物。

47、2、本發(fā)明最終篩選得到抗菌活性最高、在所測(cè)試濃度范圍(256μm)內(nèi)沒有明顯溶血現(xiàn)象的抗菌肽fuk：gfufukkfufukki-nh2。