本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程，尤其是指一種產(chǎn)l-色氨酸的工程化丁酸梭菌及其在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、癌癥是一種嚴(yán)重威脅人群健康的疾病。隨著近年來對(duì)癌癥治療方法的探索，免疫療法由于其顯著的臨床治療效果得到了越來越多的關(guān)注。盡管能讓有響應(yīng)的患者大概率獲得長期存活，但是腫瘤患者的總體響應(yīng)率比較低，很大程度上限制了腫瘤免疫治療的臨床效果。因此，需要發(fā)展新型腫瘤免疫治療策略來抑制腫瘤和提升治療效果。過去十幾年，微生物群在癌癥免疫療法中發(fā)揮了重要作用。在臨床前和臨床試驗(yàn)中，用活細(xì)菌靶向腫瘤微環(huán)境是一種很有前途的免疫治療策略。一些細(xì)菌，特別是專性和兼性厭氧菌株，可以優(yōu)先定殖于缺氧和富含血管系統(tǒng)的腫瘤微環(huán)境中，以引發(fā)免疫反應(yīng)。然而，靜脈注射細(xì)菌用于癌癥治療也存在細(xì)菌存活率低和腫瘤積聚不良等問題。為提高治療腫瘤的可行性，越來越多的研究通過基因工程對(duì)目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行改造，使其具有所需的功能，例如釋放藥物和分泌免疫刺激分子等。

2、在腫瘤中，有限的血液供應(yīng)使腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間爭(zhēng)奪營養(yǎng)物質(zhì)滿足各自需求。腫瘤通過重編程多種代謝途徑攝取大量的營養(yǎng)物質(zhì)。其中色氨酸作為一種必須氨基酸，是t細(xì)胞反應(yīng)的重要營養(yǎng)成分，也是抗腫瘤免疫反應(yīng)的重要介質(zhì)。然而，腫瘤細(xì)胞可通過吲哚胺2,3-二加氧酶的酶促活性耗盡色氨酸水平，導(dǎo)致微環(huán)境中色氨酸的缺乏和犬尿氨酸等代謝物的積聚，使效應(yīng)t細(xì)胞被抑制并建立支持癌細(xì)胞增殖和存活的免疫抑制微環(huán)境。雖然ido抑制劑在臨床前模型中顯示出前景，但仍然存在潛在的脫靶效應(yīng)等主要挑戰(zhàn)。此外，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)的ido抑制劑可能通過影響多種途徑而表現(xiàn)出毒性。如何優(yōu)化ido抑制劑的治療潛力，同時(shí)減輕其局限性，對(duì)于開發(fā)改進(jìn)的免疫治療方式和方案至關(guān)重要。

3、丁酸梭菌(clostridium?butyricum，cb)作為一種芽孢益生菌，為嚴(yán)格厭氧菌，具備良好的生理、生化特性，相較于非芽孢益生菌劑耐儲(chǔ)存、活菌數(shù)穩(wěn)定且具有免疫功能及抗氧化性。它是一種常見的微生物飼料添加劑，具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、促進(jìn)生長發(fā)育的功能。丁酸梭菌能夠促進(jìn)多種碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生丁酸。丁酸作為一種短鏈脂肪酸，可通過免疫細(xì)胞招募、激活及促抗體分泌等多種途徑作用于適應(yīng)性免疫細(xì)胞，調(diào)控宿主免疫應(yīng)答，來維持宿主免疫穩(wěn)態(tài)。而且隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)腸道菌群產(chǎn)生的丁酸不僅能夠促進(jìn)自身cd8+t細(xì)胞的免疫應(yīng)答，還可以通過降低結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)stat1水平和hdac抑制劑性質(zhì)雙重調(diào)節(jié)抑制ido的表達(dá)，調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)。綜上所述，對(duì)丁酸梭菌進(jìn)行基因改造產(chǎn)生色氨酸來靶向腫瘤微環(huán)境代謝治療是提供ido抑制劑滿足當(dāng)前腫瘤免疫治療需求的潛在策略。然而，目前用于生產(chǎn)色氨酸的微生物菌株基本都是在有氧環(huán)境下生存，缺少能高產(chǎn)色氨酸和含有厭氧特性的工程菌株治療腫瘤的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)l-色氨酸的工程化丁酸梭菌及其在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明利用thl啟動(dòng)子及pmtl82151穿梭載體，在丁酸梭菌中過表達(dá)色氨酸操縱子基因trpedcba，構(gòu)建出一株高產(chǎn)l-色氨酸的工程化丁酸梭菌。該菌株通過分泌丁酸和色氨酸代謝物，抑制ido表達(dá)，調(diào)節(jié)cd8+t細(xì)胞代謝，改變腫瘤免疫微環(huán)境。

2、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)l-色氨酸的工程化丁酸梭菌，在丁酸梭菌中過表達(dá)色氨酸操縱子基因trpedcba。

3、進(jìn)一步地，使用thl啟動(dòng)子過表達(dá)色氨酸操縱子基因trpedcba。

4、進(jìn)一步地，使用穿梭載體pmtl82151表達(dá)色氨酸操縱子基因trpedcba。

5、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種產(chǎn)l-色氨酸的工程化丁酸梭菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

6、s1、構(gòu)建質(zhì)粒pmtl82151-trpedcba；

7、s2、使用質(zhì)粒pmtl82151-trpedcba轉(zhuǎn)染大腸桿菌，得到重組大腸桿菌；

8、s3、將所述重組大腸桿菌與丁酸梭菌混合培養(yǎng)，使pmtl82151-trpedc?ba共軛轉(zhuǎn)移至丁酸梭菌，得到所述工程化丁酸梭菌。

9、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供包含上述工程化丁酸梭菌的微生物菌劑。

10、進(jìn)一步地，將上述工程化丁酸梭菌在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)并收集上清液得到代謝產(chǎn)物。

11、進(jìn)一步地，硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基包括酪胨15g/l，酵母浸出粉5g/l，葡萄糖5g/l，硫乙醇酸鈉0.5g/l，氯化鈉2.5g/l，l-胱氨酸0.5g/l，瓊脂0.75g/l，刃天青0.001g/l。

12、進(jìn)一步地，培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)。

13、本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述工程化丁酸梭菌、上述微生物菌劑或上述代謝產(chǎn)物在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。

14、進(jìn)一步地，所述腫瘤包括結(jié)腸腫瘤。

15、進(jìn)一步地，所述藥物使用靜脈注射給藥。

16、本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供上述工程化丁酸梭菌或上述微生物菌劑在制備促進(jìn)t細(xì)胞代謝的藥物中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供上述工程化丁酸梭菌或上述微生物菌劑在制備ido抑制劑中的應(yīng)用。

18、本發(fā)明的有益效果：

19、本發(fā)明通過基因工程技術(shù)，構(gòu)建了一株高產(chǎn)l-色氨酸的工程化丁酸梭菌，該菌株無需經(jīng)過額外處理，在小鼠體內(nèi)能夠特異性靶向并定殖于腫瘤，通過分泌丁酸和色氨酸代謝物，抑制ido表達(dá)，調(diào)節(jié)cd8+t細(xì)胞代謝，改變腫瘤免疫微環(huán)境，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的目的，并且不會(huì)影響體內(nèi)主要器官的生理結(jié)構(gòu)，具有良好的安全性。

技術(shù)特征：

1.一種產(chǎn)l-色氨酸的工程化丁酸梭菌，其特征在于：在所述工程化丁酸梭菌中過表達(dá)色氨酸操縱子基因trpedcba。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化丁酸梭菌，其特征在于：使用thl啟動(dòng)子過表達(dá)色氨酸操縱子基因trpedcba。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化丁酸梭菌，其特征在于：使用穿梭載體pmtl82151表達(dá)色氨酸操縱子基因trpedcba。

4.一種產(chǎn)l-色氨酸的工程化丁酸梭菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

5.包含權(quán)利要求1-3任一所述工程化丁酸梭菌的微生物菌劑。

6.權(quán)利要求1-3任一所述的工程化丁酸梭菌、權(quán)利要求5所述的微生物菌劑在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述腫瘤包括結(jié)腸腫瘤。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述藥物使用靜脈注射給藥。

9.權(quán)利要求1-3任一所述的工程化丁酸梭菌或權(quán)利要求5所述的微生物菌劑在制備促進(jìn)t細(xì)胞代謝的藥物中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求1-3任一所述的工程化丁酸梭菌或權(quán)利要求5所述的微生物菌劑在制備ido抑制劑中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)L?色氨酸的工程化丁酸梭菌及其在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用thl啟動(dòng)子及pMTL82151穿梭載體，在丁酸梭菌中過表達(dá)色氨酸操縱子基因trpEDCBA，構(gòu)建出一株高產(chǎn)L?色氨酸的工程化丁酸梭菌。該菌株無需經(jīng)過額外處理，在小鼠體內(nèi)能夠特異性靶向并定殖于腫瘤，通過分泌丁酸和色氨酸代謝物，抑制IDO酶表達(dá)，調(diào)節(jié)CD8<supgt;+</supgt;T細(xì)胞代謝，改變腫瘤免疫微環(huán)境，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的目的，并且不會(huì)影響體內(nèi)主要器官的生理結(jié)構(gòu)，具有良好的安全性。

技術(shù)研發(fā)人員：汪超,汪恒
受保護(hù)的技術(shù)使用者：蘇州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21