本發(fā)明涉及一種化合物及其制備方法，尤其是一種具有抗炎、抗腫瘤、降糖降脂、抗菌等作用的化合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：當(dāng)今，隨著現(xiàn)代藥理學(xué)、分子生物學(xué)等理論及相關(guān)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，天然藥物的開發(fā)途徑和手段也在不斷創(chuàng)新。目前，開發(fā)新藥的途徑大致有三條，即民間藥途徑、經(jīng)驗(yàn)藥途徑和分子途徑。其中隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)及信息處理技術(shù)等的發(fā)展，分子途徑已逐漸成為開發(fā)新藥的主要途徑。但是基于我國目前國情，且由于技術(shù)設(shè)備的局限性，目前民間藥途徑、經(jīng)驗(yàn)藥途徑是我國開發(fā)新藥的主要途徑，而這兩種途徑又是以藥用植物為主體。以藥用植物為主體發(fā)展起來的藥物，在歷史上對人類的防病治病、康復(fù)保健和生育繁衍起到了巨大的作用。天然藥物來源途徑甚多，大多來源于植物；據(jù)估計(jì)，全球約有40～50萬種植物，但僅有極少部分進(jìn)行過化學(xué)成分及其活性測試研究，我國也是植物資源最豐富的國家之一，因此充分挖掘和利用自然界結(jié)構(gòu)多樣性的化合物開發(fā)新的天然藥物，促進(jìn)我國醫(yī)藥科技高速前進(jìn)，開拓新的市場，推動我國天然藥物的發(fā)展，迎接醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)全球化挑戰(zhàn)具有重要的意義。藥用植物是開發(fā)新藥的重要來源，目前，全球批準(zhǔn)的新藥中，接近半數(shù)是天然藥物，藥物來自天然產(chǎn)物?，F(xiàn)今，世界上還有近60％的人口還完全依靠植物藥來防治疾病。但隨著疾病的衍變，病毒抗藥性、機(jī)體耐藥性等問題，單純的依靠某種藥用植物，或藥用植物中所含成分為前體來研發(fā)的新藥，已遠(yuǎn)不能滿足人們對藥物的需要。針對某種特定的疾病，人們往往是要將兩種或兩種以上的，甚至更多的藥物同時服用才能起到一定的治療作用。中藥黃連主要包括毛茛科黃連、三角葉黃連、云連的干燥根莖。黃連素學(xué)名小檗堿，是中藥黃連中的主要生物堿。小檗堿屬異喹啉類生物堿，近年來研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿及其衍生物在治療腫瘤、糖尿病、心血管疾病、高血脂、炎癥、細(xì)菌和病毒感染、腦缺血性損傷、精神疾病、阿爾茨海默病(老年癡呆癥)、骨質(zhì)疏松等多方面具有藥理作用。二甲雙胍是西藥經(jīng)典的降糖藥,近年來研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍除了具有良好的降糖效果外，在抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、抗菌方面也有很好的療效，研究發(fā)現(xiàn)小檗堿的溶解度隨ph的增加而增大，ph13時，小檗堿的油水分配系數(shù)最大，而二甲雙胍是強(qiáng)堿性脂肪胺，ph＝12.4，可增加小檗堿的溶解度，提高生物利用度。二甲雙胍在體內(nèi)的消除半衰期約為1.25-2.8小時，導(dǎo)致其給藥次數(shù)增加，患者依從性差，小檗堿雖然在體內(nèi)吸收差，但是吸收入血的藥物分布廣，半衰期長，彌補(bǔ)二甲雙胍半衰期短的缺點(diǎn)，并且小檗堿可以改善腎損傷患者病理變化，促進(jìn)二甲雙胍排泄，減少乳酸性酸中毒?；谝陨弦蛩兀瑢⒍叻肿幽负似唇釉谝黄?，能否增加小檗堿的生物利用度，降低腎病患者乳酸性酸中毒的風(fēng)險，將二者采用化學(xué)合成的方法，有目的的拼接起來，看其某些藥理作用能否增強(qiáng)，是否能達(dá)到1+1≥2，增效減毒的作用，能否突出二者抗抗炎、降糖降酯的藥理作用等，這些都是未知不可預(yù)料的，也是現(xiàn)有技術(shù)中沒有任何公開或報道的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種新的化合物，所述化合物的毒性比小檗堿的毒性小，而且具有更好的抗炎、抗腫瘤抗癌、降糖降脂、抗菌等作用。同時，本發(fā)明還提供所述化合物的制備方法及用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種化合物，所述化合物的結(jié)構(gòu)式為：本發(fā)明所述化合物由小檗紅堿和二甲雙胍通過特定的反應(yīng)合成，其能夠顯著降低小檗堿的毒性，而且能夠達(dá)到1+1≥2，起到增效減毒的作用，在抗炎、抗腫瘤抗癌、降糖降脂和抗菌等方面具有更好的效果。另外，本發(fā)明公開一種上述所述化合物的制備方法，其包括以下步驟：(1)將式(1)所示化合物與溴代劑在溶劑a中進(jìn)行溴代反應(yīng)，得到式(2)所示化合物；(2)將步驟(1)中得到的式(2)化合物在堿催化劑的作用下，與式(3)所示化合物在溶劑b中發(fā)生環(huán)合反應(yīng)，即得到本發(fā)明所述式(4)化合物。本發(fā)明所述化合物的制備方法，通過特定的方式將小檗紅堿和二甲雙胍的母核環(huán)合在一起，但是這種環(huán)合并不是盲目的，而是在中醫(yī)藥臨床用藥經(jīng)驗(yàn)的指導(dǎo)下以及有機(jī)化學(xué)的基礎(chǔ)上，有目的、有選擇的將二者結(jié)合一起，發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合后能夠起到增效減毒的效果，而且本發(fā)明的方法操作簡單，能夠快速高效得到本發(fā)明所述化合物。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中溴代劑為溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、溴乙酸丁酯、氯乙酸甲酯、氯乙酸乙酯、氯乙酸丁酯、碘乙酸甲酯中的至少一種。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中溴代劑為溴乙酸甲酯。當(dāng)所述溴代劑選擇溴乙酸甲酯時，所述溴乙酸甲酯分子中的兩個碳既可以克服分子間的阻力，保證親核取代反應(yīng)的發(fā)生，又保持了所合成化合物的穩(wěn)定性，避免其在體內(nèi)不穩(wěn)定而分解。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中溶劑a為乙腈、dmf、甲醇、丙酮、乙醇、二甲基亞砜、四氫呋喃、二氯甲烷、二甲基亞砜、二氧六環(huán)中的至少一種。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中的溶劑a為二氯甲烷。當(dāng)所述步驟(1)中的溶劑a選擇二氯甲烷時，二氯甲烷對步驟(1)反應(yīng)的反應(yīng)物溶解性較好，且黏度小，沸點(diǎn)低，極性適中，在既保證了產(chǎn)物收率的前提下，又易于后處理，回收溶劑。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)中堿催化劑為甲醇鈉、乙醇鈉、金屬鈉中的至少一種。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)中的堿催化劑為甲醇鈉。本申請發(fā)明人通過大量研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所述堿催化劑選擇甲醇鈉時，產(chǎn)物的收率明顯高于其他堿催化劑。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)中溶劑b為乙腈、dmf、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、吡啶、喹啉、二甲基亞砜、四氫呋喃、二氯甲烷、二甲基亞砜、二氧六環(huán)中的至少一種。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)中的溶劑b為甲醇。甲醇對步驟(2)反應(yīng)的反應(yīng)物溶解性較好，且黏度小，沸點(diǎn)低，極性適中，在既保證了產(chǎn)物收率的前提下，又易于后處理，回收溶劑。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的最優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中的溶劑a為二氯甲烷，溴代劑為溴乙酸甲酯；所述步驟(2)中的溶劑b為甲醇，堿催化劑為甲醇鈉。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中溶劑a與式(1)化合物的摩爾比為5:1～20:1，溴代劑與式(1)化合物的摩爾比為0.8:1～3:1。作為本發(fā)明所述化合物的制備法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)中堿催化劑與式(2)化合物的摩爾比為0.04:1～5:1，溶劑b與式(2)化合物的摩爾比為5:1～20:1，式(3)化合物與式(2)化合物的摩爾比為0.5:1～5:1。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中溴代反應(yīng)溫度為30～80℃，反應(yīng)時間為3～12小時。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中溴代反應(yīng)溫度為30～80℃，反應(yīng)時間為8～10小時。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)中環(huán)合反應(yīng)的溫度為40～100℃，反應(yīng)時間為3～20小時。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)中環(huán)合反應(yīng)的溫度為60～70℃，反應(yīng)時間為12-20小時。本申請發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所述步驟(1)中的溴代反應(yīng)溫度為40℃、反應(yīng)時間為8h，步驟(2)中的環(huán)合反應(yīng)的溫度為65℃、反應(yīng)時間為16小時時，既能保證產(chǎn)物收率，又具有較好的經(jīng)濟(jì)性。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)的具體方法為：將式(1)所示化合物加入干凈的三口燒瓶中，加入溶劑a，緩慢加入溴代劑，待溫度至40℃時，回流反應(yīng)，hplc監(jiān)測反應(yīng)，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時停止反應(yīng)，待溫度降至20-30℃，析晶，然后抽濾、洗滌、干燥，即得式(2)所示化合物。優(yōu)選的，所述析晶反應(yīng)時，采用加入適量95％乙醇進(jìn)行析晶，析晶后攪拌析晶2h后，再進(jìn)行抽濾、洗滌、干燥。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)的具體方法為：將式(3)所示化合物加入干凈的三口燒瓶中，加入溶劑b和堿催化劑，攪拌30分鐘，然后加入步驟(1)得到的式(2)所示化合物，在溫度為60-70℃下反應(yīng)3～20小時，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行冷卻，抽濾，洗滌，然后干燥，再進(jìn)行析晶，有橙黃色晶體析出，然后抽濾、干燥，即得本發(fā)明所述化合物。優(yōu)選的，反應(yīng)結(jié)束后用熱的甲醇萃取5次，熱甲醇的溫度為60℃，萃取結(jié)束后，沉淀加入鹽酸-乙醇溶液，析晶，抽濾，干燥，得到本發(fā)明的化合物。作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中式(1)化合物采用以下方法制備而成：將式(5)所示化合物在溶劑c中于120～170℃下反應(yīng)，使其9位甲基脫去，得到式(1)所示化合物；其中所述溶劑c為dmf、dmac、dmso、hmpt、hept、nmp、二苯醚、吡啶、喹啉中的一種，所述溶劑c與式(5)所示化合物的摩爾比為5:1～20:1；作為本發(fā)明所述化合物的制備方法的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)中式(1)所示化合物采用以下方法制備而成：將式(5)所示化合物置于干燥潔凈的三口燒瓶中，加入溶劑c，于電加熱套中加熱回流反應(yīng)，在溫度為120-170℃下反應(yīng)，反應(yīng)過程用hplc監(jiān)測，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時停止反應(yīng)，待溫度降至120℃以下，邊攪拌邊加入純的冰水，置于冰箱中靜置析晶，溫度為4℃左右，然后抽濾、洗滌，干燥即得式(1)所示化合物。本發(fā)明所述步驟(1)中式(1)所示化合物可以直接購于市場，也可以采用上述所述方法由式(5)所示化合物制備而成。另外，本發(fā)明還提供了以上所述化合物在制備用于治療腫瘤、癌癥、高血糖、高血脂、心腦血管疾病的藥物中的用途。本發(fā)明所述化合物是發(fā)明人在中醫(yī)藥臨床用藥經(jīng)驗(yàn)以及有機(jī)化學(xué)的指導(dǎo)下，有目的、有選擇的將小檗紅堿和二甲雙胍通過特定的合成方法結(jié)合在一起而得，所述化合物具有增效減毒的效果，在抗炎、抗腫瘤、抗癌、降糖降脂、抗菌、抗心腦血管疾病等方面具有更好的效果。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所述化合物由小檗紅堿和二甲雙胍通過特定的反應(yīng)合成，其能夠顯著降低小檗堿的毒性，而且能夠達(dá)到1+1≥2的藥理作用，起到增效減毒的作用；本發(fā)明所述化合物的制備方法操作簡單，能夠快速高效的得到本發(fā)明所述化合物，并且所得化合物在制備用于治療腫瘤、癌癥、高血糖、高血脂、心腦血管疾病等的藥物中具有重要用途，為制備治療腫瘤、癌癥、高血糖、高血脂、心腦血管疾病等的藥物提供了新的藥物選擇。附圖說明圖1為本發(fā)明所述化合物的高分辨質(zhì)譜圖；圖2為本發(fā)明所述化合物的紅外光譜圖；圖3為本發(fā)明所述化合物的紫外光譜圖；圖4為本發(fā)明所述化合物的核磁共振氫譜碳譜圖；圖5為本發(fā)明所述化合物的核磁共振氫譜碳譜圖。具體實(shí)施方式為更好地說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。以下實(shí)施例所用式(1)～(5)的化合物的結(jié)構(gòu)式分別如下所示：實(shí)施例1本發(fā)明所述化合物的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述化合物采用以下方法制備而成：(1)將式(5)化合物置于干燥潔凈的三口燒瓶中，向三口燒瓶中加入dmac，所述dmac與式(5)化合物的摩爾比為5:1，然后于電加熱套中加熱回流反應(yīng)，反應(yīng)溫度為120-170℃，采用hplc監(jiān)測反應(yīng)，當(dāng)原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時，停止反應(yīng)；待溫度降至120℃以下，邊攪拌邊加入純的冰水，置于冰箱中靜置析晶，溫度為4℃度左右，然后抽濾、洗滌，干燥即得式(1)的化合物；本步驟中，所得式(1)化合物的收率為75％，純度為97％(2)將式(1)的化合物加入干燥潔凈的三口燒瓶中，加入二氯甲烷，所述二氯甲烷與式(1)化合物的摩爾比為20:1，緩慢加入溴乙酸甲酯，所加入的溴乙酸甲酯與式(1)化合物的摩爾比為0.8:1，溫度升至40℃左右，回流反應(yīng)8小時，hplc監(jiān)測反應(yīng)，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時停止反應(yīng)，待溫度降至室溫，加入適量95％乙醇進(jìn)行析晶，析晶后攪拌析晶2h后，再進(jìn)行抽濾、洗滌、干燥，即得式(2)的化合物；本步驟中，所得式(2)化合物的收率為85％，純度為98％；(3)將式(3)化合物加入干凈的三口燒瓶中，加入甲醇和甲醇鈉-甲醇溶液，所加入的甲醇與式(2)化合物的摩爾比為20:1，所加入的甲醇鈉與式(2)化合物的摩爾比為0.04:1，攪拌30分鐘，緩慢加入步驟(1)得到的式(2)的化合物，所加入的式(3)化合物與式(2)化合物的摩爾比為0.5:1，在溫度為65℃下反應(yīng)16小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、抽濾、干燥，得到式(4)的化合物，即得本發(fā)明所述化合物；本步驟中所得式(4)的化合物，收率為33.5％，純度為49％，經(jīng)過熱甲醇洗滌、鹽酸-乙醇等方法精制純化后純度為95％以上，即得本發(fā)明的化合物。實(shí)施例2本發(fā)明所述化合物的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述化合物采用以下方法制備而成：(1)將式(5)化合物置于干燥潔凈的三口燒瓶中，向三口燒瓶中加入dmso，所述dmso與式(5)化合物的摩爾比為10:1，然后于電套中加熱回流反應(yīng)，反應(yīng)溫度為120-170℃，采用hplc監(jiān)測反應(yīng)，當(dāng)原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時，停止反應(yīng)；待溫度降至120℃以下，邊攪拌邊加入純的冰水，置于冰箱中靜置析晶，溫度為4℃左右，然后抽濾、洗滌，干燥即得式(1)的化合物；本步驟中，所得式(1)化合物的收率為72％，純度為96％；(2)將式(1)的化合物加入干燥潔凈的三口燒瓶中，加入二氯甲烷，加熱，所述二氯甲烷與式(1)化合物的摩爾比為20:1，緩慢加入氯乙酸甲酯，所加入的氯乙酸甲酯與式(1)化合物的摩爾比為1:1，溫度升至40℃左右，回流反應(yīng)8小時，hplc監(jiān)測反應(yīng)，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時停止反應(yīng)，待溫度室溫，加入適量95％乙醇進(jìn)行析晶，析晶后攪拌析晶2h后，再進(jìn)行抽濾、洗滌、干燥，即得式(2)的化合物；本步驟中，所得式(2)化合物的收率為80％，純度為98％；(3)將式(3)的化合物加入干凈的三口燒瓶中，加入甲醇和乙醇鈉-乙醇溶液，所加入的乙醇與式(2)化合物的摩爾比為20:1，所加入的乙醇鈉與式(2)化合物的摩爾比為0.04:1，攪拌30分鐘，緩慢加入步驟(1)得到的式(2)的化合物，所加入的式(3)化合物與式(2)化合物的摩爾比為3:1，在溫度為65℃下反應(yīng)16小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、抽濾、干燥，得到式(4)的化合物，即得本發(fā)明所述化合物；經(jīng)過熱甲醇洗滌、鹽酸-乙醇等方法精制純化后，即得純度為95％以上的本發(fā)明所述化合物；本步驟中所得式(4)的化合物，收率為30％，純度為49％，經(jīng)過熱甲醇洗滌、鹽酸-乙醇等方法精制純化后純度為95％以上。實(shí)施例3本發(fā)明所述化合物的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述化合物采用以下方法制備而成：(1)將式(5)化合物置于干燥潔凈的三口燒瓶中，向三口燒瓶中加入dmf，所述dmf與式(5)化合物的摩爾比為15:1，然后于電套中加熱回流反應(yīng)，反應(yīng)溫度為120-170℃，采用hplc監(jiān)測反應(yīng)，當(dāng)原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時，停止反應(yīng)；待溫度降至120℃以下，邊攪拌邊加入純的冰水，置于冰箱中靜置析晶，溫度為4℃左右，然后抽濾、洗滌，干燥即得式(1)的化合物；本步驟中，所得式(1)化合物的收率為71％，純度為97％；(2)將式(1)的化合物加入干燥潔凈的三口燒瓶中，加入二氯甲烷，加熱，所述二氯甲烷與式(1)化合物的摩爾比為20:1，緩慢加入氯乙酸甲酯，所加入的氯乙酸甲酯與式(1)化合物的摩爾比為3:1，溫度升至40℃左右，回流反應(yīng)8小時，hplc監(jiān)測反應(yīng)，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時停止反應(yīng)，待溫度降至室溫，加入適量95％乙醇進(jìn)行析晶，析晶后攪拌析晶2h后，再進(jìn)行抽濾、洗滌、干燥，即得式(2)的化合物；本步驟中，所得式(2)化合物的收率為80％，純度為97％；(3)將金屬鈉用錫紙包好，用針扎孔，投入甲醇溶液中，待金屬鈉全部溶解，將錫紙取出，溶液備用，將式(3)的化合物加入干凈的三口燒瓶中，與金屬鈉反應(yīng)后的甲醇溶液，所加入的甲醇溶液與式(2)化合物的摩爾比為20:1，所加入的金屬鈉與式(2)化合物的摩爾比為0.04:1，攪拌30分鐘，緩慢加入步驟(1)得到的式(2)的化合物，所加入的式(3)化合物與式(2)化合物的摩爾比為5:1，在溫度為65℃下反應(yīng)16小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、抽濾、干燥，得到式(4)的化合物，即得本發(fā)明化合物；經(jīng)過熱甲醇洗滌、鹽酸-乙醇等方法精制純化后，得到純度為97％的本發(fā)明所述化合物；本步驟中所得式(4)的化合物，收率為28％，純度為49％，經(jīng)過熱甲醇洗滌、鹽酸-乙醇等方法精制純化后純度為97％，即得本發(fā)明的化合物。實(shí)施例4本發(fā)明所述化合物的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述化合物采用以下方法制備而成：(1)將式(5)化合物置于干燥潔凈的三口燒瓶中，向三口燒瓶中加入hmpt，所述hmpt與式(5)化合物的摩爾比為20:1，然后于電加熱套套中加熱回流反應(yīng)，反應(yīng)溫度為120-170℃，采用hplc監(jiān)測反應(yīng)，當(dāng)原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時，停止反應(yīng)；待溫度降至120℃以下，邊攪拌邊加入純的冰水，置于冰箱中靜置析晶，溫度為零度左右，然后抽濾、洗滌，干燥即得式(1)的化合物；本步驟中，所得式(1)化合物的收率為66％，純度為98％；(2)將式(1)的化合物加入干燥潔凈的三口燒瓶中，加入乙腈，加熱，所述乙腈與式(1)化合物的摩爾比為5:1，緩慢加入溴乙酸乙酯，所加入的溴乙酸乙酯與式(1)化合物的摩爾比為0.8:1，溫度升至70℃左右，回流反應(yīng)6小時，hplc監(jiān)測反應(yīng)，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時停止反應(yīng)，待溫度降至室溫，加入適量95％乙醇進(jìn)行析晶，析晶后攪拌析晶2h后，再進(jìn)行抽濾、洗滌、干燥，所得式(2)化合物的收率為78％，純度為92％；(3)將式(3)的化合物加入干凈的三口燒瓶中，加入甲醇乙醇混合溶液和甲醇鈉-甲醇溶液，所加入的甲醇乙醇混合溶液與式(2)化合物的摩爾比為20:1，所加入的甲醇鈉與式(2)化合物的摩爾比為0.05:1，攪拌30分鐘，緩慢加入步驟(1)得到的式(2)的化合物，所加入的式(3)化合物與式(2)化合物的摩爾比為3:1，在溫度為65℃下反應(yīng)16小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、抽濾、干燥，得到式(4)的化合物，即得本發(fā)明化合物；經(jīng)過熱甲醇洗滌、鹽酸-乙醇等方法精制純化后，得到純度為97％的本發(fā)明所述化合物；本步驟中所得式(4)的化合物，收率為30％，純度為49％，經(jīng)過熱甲醇洗滌、鹽酸-乙醇等方法精制純化后純度為97％。實(shí)施例5本發(fā)明所述化合物的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述化合物采用以下方法制備而成：(1)將式(5)化合物置于干燥潔凈的三口燒瓶中，向三口燒瓶中加入吡啶，所述吡啶與式(5)化合物的摩爾比為8:1，然后于電加熱套中加熱回流反應(yīng)，反應(yīng)溫度為120-170℃，采用hplc監(jiān)測反應(yīng)，當(dāng)原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時，停止反應(yīng)；待溫度降至120℃以下，邊攪拌邊加入純的冰水，置于冰箱中靜置析晶，溫度為4℃左右，然后抽濾、洗滌，干燥即得式(1)的化合物；本步驟中，所得式(1)化合物的收率為72％，純度為95％；(2)將式(1)的化合物加入干燥潔凈的三口燒瓶中，加入四氫呋喃，加熱，所述四氫呋喃與式(1)化合物的摩爾比為20:1，緩慢加入溴乙酸乙酯，所加入的溴乙酸乙酯與式(1)化合物的摩爾比為0.8:1，溫度升至70℃左右，回流反應(yīng)6小時，hplc監(jiān)測反應(yīng)，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時停止反應(yīng)，待溫度降至室溫，加入適量95％乙醇進(jìn)行析晶，析晶后攪拌析晶2h后，再進(jìn)行抽濾、洗滌、干燥，所得式(2)化合物的收率為75％，純度為92％；(3)將式(3)的化合物加入干凈的三口燒瓶中，加入四氫呋喃和甲醇鈉-甲醇溶液，所加入的四氫呋喃與式(2)化合物的摩爾比為20:1，所加入的甲醇鈉與式(2)化合物的摩爾比為0.1:1，攪拌30分鐘，緩慢加入步驟(1)得到的式(2)的化合物，所加入的式(3)化合物與式(2)化合物的摩爾比為4:1，在溫度為65℃下反應(yīng)16小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、抽濾、干燥，得到式(4)的化合物，即得本發(fā)明化合物；本步驟中所得式(4)的化合物，收率為31％，純度為49％，經(jīng)過熱甲醇洗滌、鹽酸-乙醇等方法精制純化后純度為95％。實(shí)施例6本發(fā)明所述化合物的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述化合物采用以下方法制備而成：(1)將式(5)化合物置于干燥潔凈的三口燒瓶中，向三口燒瓶中加入二苯醚，所述二苯醚與式(5)化合物的摩爾比為12:1，然后于電加熱套中加熱回流反應(yīng)，反應(yīng)溫度為120-170℃，采用hplc監(jiān)測反應(yīng)，當(dāng)原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時，停止反應(yīng)；待溫度降至120℃以下，邊攪拌邊加入純的冰水，置于冰箱中靜置析晶，溫度為4℃左右，然后抽濾、洗滌，干燥即得式(1)的化合物；本步驟中，所得式(1)化合物的收率為68％，純度為96％；(2)將式(1)的化合物加入干燥潔凈的三口燒瓶中，加入二氯甲烷和二氧六環(huán)的混合物，所述二氯甲烷和二氧六環(huán)的混合物中，所述二氯甲烷和二氧六環(huán)的質(zhì)量比為2:1，加熱，所述二氯甲烷和二氧六環(huán)的混合物與式(1)化合物的摩爾比為10:1，緩慢加入溴乙酸丁酯，所加入的溴乙酸丁酯與式(1)化合物的摩爾比為2:1，溫度升至100℃左右，回流反應(yīng)5小時，hplc監(jiān)測反應(yīng)，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時停止反應(yīng)，待溫度降至室溫，加入適量95％乙醇進(jìn)行析晶，析晶后攪拌析晶2h后，再進(jìn)行抽濾、洗滌、干燥，即得式(2)的化合物；本步驟中，所得式(2)化合物的收率為70％，純度為95％；(3)將式(3)的化合物加入干凈的三口燒瓶中，加入四氫呋喃和甲醇鈉-甲醇溶液，所加入的四氫呋喃與式(2)化合物的摩爾比為5:1，所加入的甲醇鈉與式(2)化合物的摩爾比為0.1:1，攪拌30分鐘，緩慢加入步驟(1)得到的式(2)的化合物，所加入的式(3)化合物與式(2)化合物的摩爾比為5:1，在溫度為65℃下反應(yīng)16小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、抽濾、干燥，得到式(4)的化合物；本步驟中所得式(4)的化合物，收率為25％，純度為49％，經(jīng)過熱甲醇洗滌、鹽酸-乙醇等方法精制純化后純度為98％。。實(shí)施例7本發(fā)明所述化合物的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述化合物采用以下方法制備而成：(1)從市場直接購買式(1)的化合物，其純度為99％；(2)將式(1)的化合物加入干燥潔凈的三口燒瓶中，加入乙腈和甲醇的混合物，所述乙腈和甲醇的混合物中，所述乙腈和甲醇的質(zhì)量比為1:4，加熱，所述乙腈和甲醇的混合物與式(1)化合物的摩爾比為8:1，緩慢加入溴乙酸乙酯，所加入的溴乙酸乙酯與式(1)化合物的摩爾比為2:1，在溫度為67℃下回流反應(yīng)12小時，hplc監(jiān)測反應(yīng)，原料基本反應(yīng)完全或產(chǎn)物不再增加時停止反應(yīng)，加入適量95％乙醇進(jìn)行析晶，析晶后攪拌析晶2h后，再進(jìn)行抽濾、洗滌、干燥，即得式(2)的化合物；本步驟中，所得式(2)化合物的收率為80％，純度為95％；(3)將式(3)的化合物加入干凈的三口燒瓶中，加入乙腈和dmf的混合物、和n,n-二異丙基乙胺，所加入的乙腈和dmf的混合物中，乙腈與dmf的質(zhì)量比為1:1，所述乙腈和dmf的混合物與式(2)化合物的摩爾比為6:1；所述n,n-二異丙基乙胺與式(2)化合物的摩爾比為2:1，加入甲醇鈉，攪拌30分鐘，緩慢加入步驟(1)得到的式(2)的化合物，所加入的式(3)化合物與式(2)化合物的摩爾比為0.5:1，在溫度為65℃下反應(yīng)16小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、抽濾、干燥，得到式(4)的化合物，即得本發(fā)明化合物；本步驟中所得式(4)的化合物，收率為29％，純度為49％，經(jīng)過熱甲醇洗滌、鹽酸-乙醇等方法精制純化后純度為95％。實(shí)施例8本發(fā)明所述化合物圖譜由附圖2～5可看出，本發(fā)明的化合物，m.p.210.5～214.9℃,esi-msm/z:471.1666[m]+；ir(kbr)νmax:1674.87,1600.63,1533.38,1491.67,1405.85,1237.11,1038.48,935.306,772.351(cm-1)；1hnmr(500mhz,dcood),δ(ppm)7.173(s,2h,o-ch3-o),6.952(s,1h,c12-h),6.745(s,1h,c8-h,),6.417(d,2h,c1-h,c4-h),5.843(s,1h,c13-h),5.486(s,2h,ch2-o),5.026(d,2h,c6-h,),3.107(s,3h,och3),2.219(s,3h,n-ch3),2.174(d,5h,c5-h,n-ch3)；13cnmr(mhz,dcood),δ(ppm):166.56(och2o),161.46(c2),159.79(c5a),156.49(n-c-n),156.03(n-c-n)151.41c1a),148.97(n-c＝n),147.80(c1),143.05(c7a),142.21(c10),132.76(c12),131.08(c9a),130.94(c12a),123.97(c9),121.23(c2),120.55(c11),108.95(c13),106.45(c8),103.02(o-ch2),102.50(c4),58.36(och3),53.72(c6),38.16(n-ch3),37.94(n-ch3),27.15(c5)。實(shí)施例9本發(fā)明所述化合物的抗炎效果試驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器實(shí)驗(yàn)材料：raw264.7巨噬細(xì)胞(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，胎牛血清(fbs,gibco)；高糖培養(yǎng)基(dmem,gibco)，0.25％胰蛋白酶(gibco)；青霉素-鏈霉素雙抗(gibco)；磷酸鹽緩沖液(pbs，hyclone)；mtt粉末(sigma)；dmso(sigma)；布洛芬(sigma)；lps(sigma)，氨基胍(中國食品藥品檢定研究所)主要儀器：hhs型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；kdc-220hr高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)，tdl80-2b低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；bp210d分析天平(sartorius)；hf90co2培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；顯微鏡；sw-cj-1fd超凈臺(蘇凈安泰)；wh-2微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠)；bx51熒光顯微鏡(olymous)。2、溶液的配制細(xì)胞培養(yǎng)基的配置：dmem：fbs：雙抗＝98：10：1，細(xì)胞凍存液的配置：fbs：dmso＝9：1，mtt溶液的配制方法:稱取mtt500mg，溶于100ml的pbs中，配置的mtt濃度為5mg/ml，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放-20℃避光保存即可。3、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇：①從液氮罐或者-86℃超低溫冰箱中取出凍存的細(xì)胞株，迅速置入37℃恒溫水浴鍋中，不斷振搖凍存管至完全融化，在1-2min內(nèi)完成操作；②75％酒精擦拭消毒外管，迅速轉(zhuǎn)置超凈臺，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至無菌離心管，加入10倍含有10％fbs的dmem培養(yǎng)基，吹打均勻；③1000rpm/min,離心5-8min，棄去上清液，加入適量的已配置培養(yǎng)基，接種于60mm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2以及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；④每兩天更換培養(yǎng)基。細(xì)胞傳代：①棄去舊的培養(yǎng)基；②pbs清洗2次，吸棄，加入適量的胰蛋白酶消化1min，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞外形變圓后，吸棄胰蛋白酶，立即加入已配培養(yǎng)基；③反復(fù)吹打皿底，使貼壁細(xì)胞完全吹落，吹打均勻，輕柔操作避免出現(xiàn)泡沫；④以1:3的比例進(jìn)行傳代。細(xì)胞的凍存：①-③步驟同細(xì)胞傳代；④將吹落的細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)至無菌離心管中，1000rpm/min，離心5-8min，棄去上清液，加入適量的已配凍存液；⑤每個凍存管液1-1.5ml，細(xì)胞終濃度為(5-10)×106/ml；⑥凍存管用封口膜封口，做好標(biāo)記，按照以下程序凍存：4℃，15-20min→-20℃，30-40min，細(xì)胞懸液呈結(jié)凍后，即可放入-86℃超低溫冰箱保存，長期保存可放入液氮罐中。(一)mtt法測定本發(fā)明化合物對raw264.7細(xì)胞增殖活性影響1、實(shí)驗(yàn)原理mtt化學(xué)名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性mtt還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(dmso)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，mtt結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)，它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。2、實(shí)驗(yàn)方法將raw264.7細(xì)胞懸液以5000個/100μl接種于96孔板，培養(yǎng)過夜?；衔餄舛炔捎枚断♂尫ǎ?個濃度梯度,每個濃度3個復(fù)孔，每孔加入用培養(yǎng)基稀釋的藥物100μl培養(yǎng)48小時后，每孔中加入10％mtt，繼續(xù)于37℃下培養(yǎng)4h，棄去上清液，加入dmso150μl，用酶標(biāo)儀讀取570nm處的吸收值,以空白對照為100％，計(jì)算化合物各劑量對細(xì)胞活力的影響，用spss軟件計(jì)算各個化合物的ic50值。布洛芬本發(fā)明化合物黃連素二甲雙胍ic50(μmol/l)55.67±4.1382.36±2.4565.13±5.6260.25±8.33實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明化合物比合成前各單體化合物和陽性對照藥布洛芬的ic50值大，表明其細(xì)胞毒毒性減小了。(二)本發(fā)明化合物對lps誘導(dǎo)raw264.7no釋放抑制作用griess法原理：細(xì)胞生成的no容易被氧化成為no2-、no3-，首先將no3-還原成為no2-，利用重氮化反應(yīng)以及偶氮化反應(yīng)生成顏色化合物，在540nm波長處有最大吸收。吸光值與no2-濃度呈正相關(guān)，從而間接得到no釋放量。考察化合物干預(yù)后細(xì)胞上清液中亞硝酸鹽含量的變化：raw264.7細(xì)胞懸液以每孔1×105個/100μl接種于96孔板。設(shè)置空白對照組(只有raw264.7細(xì)胞)，模型組(raw264.7細(xì)胞和lps)，和藥物處理組(raw264.7細(xì)胞,lps,藥物)，先用化合物采用不同藥物濃度處理(100μm-3μm)處理2小時后，再加lps，刺激維持24h后，吸取96孔板中的培養(yǎng)液100μl，加入等體積的griess反應(yīng)試劑，室溫反應(yīng)10min，酶標(biāo)儀540nm處讀取光吸收值。計(jì)算化合物各劑量在不同處理時間對細(xì)胞上清液中亞硝酸鹽抑制率。抑制率(％)＝(模型組吸光度值-各劑量藥物處理組吸光度值)/(模型組吸光度值-空白對照組吸光度)×100％。并用spss軟件計(jì)算各個化合物對no抑制的ic50值。注:所有的化合物用dmso溶解，并用培養(yǎng)基稀釋到所需要的濃度，dmso的最終濃度為0.1％，在空白對照組和模型組中加入0.1％的dmso，結(jié)果顯示對細(xì)胞沒有毒性作用。氨基胍作為陽性對照藥,平行實(shí)驗(yàn)三次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用graphpadprism軟件分析。p<0.05，p<0.01表示結(jié)果具有顯著性差異。ic50計(jì)算用spss13.0軟件中probit程序。布洛芬本發(fā)明化合物黃連素二甲雙胍ic50(μmol/l)27.25±4.5736.42±1.1341.93±5.1258.64±2.78實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明化合物ic50值小于合成前單體化合物，即抑制no釋放作用增強(qiáng)，但仍然弱于陽性對照藥。實(shí)施例10本發(fā)明所述化合物的抗菌效果試驗(yàn)(一)實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑1、實(shí)驗(yàn)材料菌株(臨床分離耐藥白色念珠球菌103、100、953和j28由長海醫(yī)院菌種保存中心贈送)，所有實(shí)驗(yàn)用菌株均于沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(sda)劃板活化，于30℃培養(yǎng)2周后，分別挑取單克隆再次劃板活化，取第二次所得單克隆置sda斜面，用上述方法培養(yǎng)后于4℃保存以備用。(1)培養(yǎng)液rpmi1640液體培養(yǎng)液的配制：rpmi1640(gibcobrl)10g，nahco32.0g，嗎啡啉丙磺酸(mops)(sigma)34.5g(0.165m)，加三蒸水900ml溶解，1nnaoh調(diào)ph至7.0(25℃)，三蒸水定容至000ml，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后于4℃保存?zhèn)溆谩?2)沙堡葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基(sda)蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂18g，加三蒸水900ml溶解，調(diào)整ph至7.0，以三蒸水定容至1000ml，高壓滅菌(121℃，15min)后于4℃保存?zhèn)溆谩?3)yepd培養(yǎng)液酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，三蒸水定容至1000ml，高壓滅菌(121℃，15min)后于4℃保存?zhèn)溆谩?、實(shí)驗(yàn)試劑氟康唑(fluconazole，fcz)注射液由大連輝瑞藥業(yè)有限公司提供，鹽酸小檗堿(berberinechloride，bbr)由上海長海醫(yī)院提供，二甲基亞砜(dimethylsulphoxide，dmso)中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司出品。3、實(shí)驗(yàn)儀器multiskanmk3型酶標(biāo)檢測儀(芬蘭labsystems產(chǎn)品)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，mjx型智能霉菌培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)thz－82a臺式恒溫振蕩器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；sw-ct-if型超凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；倒置顯微鏡(amershampharmacia產(chǎn)品)；微量加樣器(芬蘭finnpette產(chǎn)品)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(丹麥nunclon公司產(chǎn)品)(二)實(shí)驗(yàn)方法1、真菌懸液的配制實(shí)驗(yàn)前，用接種圈從4℃保存的sda培養(yǎng)基上挑取各種白念珠菌少量，接種至1mlyepd培養(yǎng)液，于30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，活化16h使真菌處于指數(shù)生長期后期。取該菌液至1mlyepd培養(yǎng)液中，用上述方法再次活化16h后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以rpmi1640培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度至1×103-5×103cfu/ml。2、藥敏反應(yīng)板的制備取無菌96孔板，于每排1號孔加rpmi1640液體培養(yǎng)基100μl作空白對照；3-12號孔各加新鮮配制的菌液100μl；2號孔分別加菌液160μl和受試化合物溶液40μl；12號孔不含藥物，只加菌液100μl作陽性生長對照。2-11號孔進(jìn)行倍比稀釋，使各孔的最終藥物濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml，各孔中dmso含量均低于1％。每次配制藥敏板的同時均制備一質(zhì)控菌藥敏板，各藥敏板于30℃恒溫箱培養(yǎng)。3、最低抑菌濃度(mic)的判定在30℃恒溫箱中，念珠菌培養(yǎng)24h后用酶標(biāo)分析儀于620nm測各孔o(hù)d值。陽性對照孔的od值控制在0.2左右，與陽性對照孔比，以od值下降80％以上的最低濃度孔中的藥物濃度為mic80(真菌生長80％被抑制時的藥物濃度)。當(dāng)藥物的mic80值超過測定濃度范圍時，按以下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：mic80值高于最高濃度64μg/ml時，計(jì)為“>64μg/ml”；mic80值為最低濃度或在最低濃度以下時，不作區(qū)別，均計(jì)為“≤0.125μg/ml”。上述實(shí)驗(yàn)均平行操作2到3次，當(dāng)mic80值能準(zhǔn)確重復(fù)或只差一個濃度時才被接受，并以較高濃度作為mic80值；當(dāng)mic80值相差兩個濃度以上時，則需重新實(shí)驗(yàn)，直到符合要求為止。青霉素本發(fā)明化合物黃連素二甲雙胍mic80(μg/ml)1.06±0.615.28±0.833.82±0.3210.54±1.38從mic80值可以看出，本發(fā)明化合物對該菌的抗菌效果不及單用的黃連素，但遠(yuǎn)好于單用的二甲雙胍姜黃素。實(shí)施例11本發(fā)明所述化合物的抗腫瘤抗癌效果試驗(yàn)以肝癌細(xì)胞株hepg2和白血病細(xì)胞株k562為例，通過探討本發(fā)明化合物對肝癌細(xì)胞株hepg2和白血病細(xì)胞株k562增殖的抑制作用中，來研究該化合物對的抗腫瘤抗癌作用。本實(shí)驗(yàn)采用sulforhodamineb(srb)染色、臺盼藍(lán)排染法、彗星電泳技術(shù)和ao/eb雙染法檢測本發(fā)明化合物對肝癌細(xì)胞株hepg2和白血病細(xì)胞株k562的毒性、抑制癌細(xì)胞增殖作用、對k562細(xì)胞dna的損傷和誘導(dǎo)k562細(xì)胞的凋亡作用。(一)材料、儀器與試劑1、材料與試劑本發(fā)明化合物(dmso配制原液，臨用前稀釋，保證dmso濃度在反應(yīng)體系中至少稀釋為1×10-2)，人肝癌細(xì)胞株hepg2和人白血病細(xì)胞株k562引自蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，培養(yǎng)基rpmi1640(美國gibcobrl)，黃酰羅丹明b(sulforhodamineb，srb，美國sigma)，臺盼藍(lán)(sigma公司)，小牛血清(杭州四季青)，其它化學(xué)試劑均為分析純。2、實(shí)驗(yàn)儀器美國precisionscientificco2培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、酶標(biāo)儀(bio-radmodel550和bio-radmodel680)、熒光顯微鏡、水平電泳槽、高速低溫離心機(jī)、costar細(xì)胞培養(yǎng)板。(二)實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)：hepg2和k562細(xì)胞分別接種于含10％小牛血清rpmi1640培養(yǎng)基中，置37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1、srb法檢測本發(fā)明化合物對hepg2細(xì)胞的毒性作用原理：sulforhodamineb(srb)是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料，粉紅色，可溶于水。srb可以與生物大分子中的堿性氨基酸結(jié)合，其在511nm的od讀數(shù)與細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系。故可用作細(xì)胞數(shù)的定量。方法：對數(shù)生長期的hepg2細(xì)胞以10×104ml-1的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24h后，向相應(yīng)孔中分別加入不同稀釋濃度的本發(fā)明化合物新鮮培養(yǎng)液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)24、48h后，棄去培養(yǎng)液，加入10％的三氯乙酸(tca)100μl，靜置5min后，將孔板移置4℃固定1h，倒掉固定液，用去離子水洗5遍，晾干。之后每孔加入100μl0.4％的srb染色10min，用1％的醋酸洗5次，自然晾干。然后每孔加入150μl10mmol·l-1的非緩沖tris堿液(unbufferedtris-basesolution，ph10.5)溶解與蛋白質(zhì)結(jié)合的srb，用振蕩器震蕩5min使其充分溶解后，用酶標(biāo)儀在515nm處測定每孔的od值。求其細(xì)胞增值率(％)＝(t-t0)/(c-t0)×100。其中c表示對照組的細(xì)胞od值；t表示加藥組的細(xì)胞od值；t0表示對照平板測定加藥時的細(xì)胞od值。在加藥前即刻將平板中接種的細(xì)胞用tca固定。如果加藥組最終的od值大于t0；說明細(xì)胞在加藥后仍然生長。如果加藥組最終的od值小于t0，說明加藥后細(xì)胞被殺死。利用回歸方程求出50％增值抑制率的藥物濃度(50％inhibitionconcentration,ic50)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，加藥組最終的細(xì)胞數(shù)小于t0，繼而說明藥物對細(xì)胞生長有抑制作用，加藥后細(xì)胞被殺死。以本發(fā)明化合物組和對照組處理hepg2細(xì)胞24h后的ic50值為例來比較各化合物對該細(xì)胞的毒性作用，ic50值如下表所示：順鉑本發(fā)明化合物黃連素二甲雙胍ic50(μmol/l)9.54±0.6220.53±1.8522.35±1.4255.38±3.85實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明化合物ic50值小于合成前單體化合物，即對hepg2細(xì)胞抑制作用增強(qiáng)，但仍然弱于陽性對照藥。2、臺盼藍(lán)排染法檢測本發(fā)明化合物對k562細(xì)胞的毒性作用原理：活細(xì)胞具有排斥臺盼藍(lán)的能力，細(xì)胞死亡后由于膜完全性的破壞，細(xì)胞即被著色。將含有臺盼藍(lán)的細(xì)胞懸液滴入白細(xì)胞計(jì)數(shù)板小室中，在光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)活細(xì)胞(未被染成藍(lán)色的細(xì)胞)。實(shí)驗(yàn)方法：濃度為10×104·ml-1的處于對數(shù)生長期的k562細(xì)胞懸液，以0.5ml·孔-1接種于24孔培養(yǎng)板中。置于37℃、％co2飽和濕度培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h后加藥。繼續(xù)培養(yǎng)24、48h后，取0.4％臺盼藍(lán)溶液0.15ml加入0.6ml細(xì)胞懸液中，充分混勻，染色5min后吸取少量混合液，注入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板小室，光學(xué)顯微鏡下數(shù)活細(xì)胞，重復(fù)3次，取其平均數(shù)。求其細(xì)胞增值率(％)＝(t-t0)/(c-t0)×100。其中c表示對照組的細(xì)胞數(shù)；t表示加藥組的細(xì)胞數(shù)；t0表示對照平板測定加藥時的細(xì)胞數(shù)。如果加藥組最終的細(xì)胞數(shù)大于t0，說明細(xì)胞在加藥后仍然生長。如果加藥組最終的細(xì)胞數(shù)小于t0，說明加藥后細(xì)胞被殺死。利用回歸方程求出ic50。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，加藥組最終的細(xì)胞數(shù)小于t0，繼而說明藥物對細(xì)胞生長有抑制作用，加藥后細(xì)胞被殺死。ic50值如下表所示：順鉑本發(fā)明化合物黃連素二甲雙胍ic50(μmol/l)20.54±2.6350.28±3.9153.25±8.4461.47±4.76實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明化合物ic50值小于合成前單體化合物，即對hepg2細(xì)胞抑制作用增強(qiáng)，但仍然弱于陽性對照藥。3、本發(fā)明所述化合物對k562細(xì)胞dna的損傷dna損傷程度在一定程度上決定細(xì)胞生死，其檢測方法用scse技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用此技術(shù)(具體方法同一般檢測細(xì)胞dna損傷方法，此處不作詳細(xì)說明)，檢測黃連素對k562細(xì)胞dna的損傷作用。將對數(shù)生長期的k562細(xì)胞以10×104·ml-1的濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5％co2飽和濕度培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h后加藥.繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞(1000r·min-1離心5min，去上清)。用冷的pbs洗兩次，加pbs混勻制成細(xì)胞懸液。4、本發(fā)明所述化合物誘導(dǎo)k562細(xì)胞凋亡原理：吖啶橙(ao)能透過胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核dna使之發(fā)射明亮的綠光。溴乙錠(eb)僅能透過胞膜受損的細(xì)胞，嵌入核dna，發(fā)橘紅色熒光。在熒光顯微鏡下觀察，可見四種細(xì)胞形態(tài)：活細(xì)胞(v)核染色質(zhì)發(fā)綠色熒光，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；早期凋亡細(xì)胞(ea)核染色質(zhì)發(fā)黃綠色熒光，呈固縮狀或圓珠狀；晚期凋亡細(xì)胞(la)核染色質(zhì)為橘紅色或橙色，結(jié)構(gòu)為固縮狀或圓珠狀；壞死細(xì)胞(n)核染色質(zhì)發(fā)橘紅色熒光，結(jié)構(gòu)正常。方法：取對數(shù)生長期的k562細(xì)胞，以5×104·ml-1接種于6孔板，每孔3ml，置于37℃、5.0％co2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后加藥。k562細(xì)胞的受試藥物濃度分別為40、80、160μm·l-1，對照組加入等體積的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24、48h后，1000r·min-1收集細(xì)胞，pbs洗一次后取100l細(xì)胞懸液與4μlao/eb染液(1：1100μg·ml-1)混勻，立即涂片，激發(fā)光波長為570nm熒光觀察并計(jì)數(shù)至少300個細(xì)胞。計(jì)算細(xì)胞凋亡率(％)＝(ea+la)/(v+n+ea+la)×100％。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。以不同濃度的本發(fā)明化合物組與對照組對k562作用24h后的細(xì)胞凋亡率為例來比較各化合物對k562細(xì)胞dna的損傷作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著化合物濃度的增大，k562細(xì)胞凋亡率增加，說明凋亡率與樣品濃度呈劑量依賴關(guān)系。實(shí)施例12本發(fā)明所述化合物的降糖作用效果試驗(yàn)以阿卡波糖為陽性對照藥，先通過體外酶抑制試驗(yàn)，測定本發(fā)明化合物對葡萄糖苷酶的抑制作用，計(jì)算其ic50值，若該值較小，則可以考慮進(jìn)行動物體內(nèi)降糖試驗(yàn)。(此處體外酶抑制試驗(yàn)方案與上述抗炎方案相似，此處不作詳細(xì)說明)，體內(nèi)降糖試驗(yàn)方法，以高血糖大鼠為受試對象，來考察本發(fā)明化合物的體內(nèi)降糖作用。高血糖大鼠建模與分組：選取清潔級sd大鼠(200±209)70只，雌雄各半，平衡飼養(yǎng)3d，建模前用血糖儀檢測全血血糖,無血糖異常情況。隨機(jī)將大鼠分為對照組10，只建模組60只，分籠飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)期間給予基礎(chǔ)飼料和滅菌自來水。建模前12h禁食不禁水，于尾部靜脈注射四氧嘧啶(6omg.kg-1體重)，對照組注射同劑量的生理鹽水。連續(xù)觀察5天后側(cè)血糖，選擇空腹血糖在13～20mmol·l-1之間實(shí)驗(yàn)用。選取建模成功糖尿病大鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別設(shè)立高血糖模型組、小檗堿組、本發(fā)明化合物組與陽性對照(二甲雙胍)組，分別用0.5％苦味酸溶液標(biāo)記，按組別分籠飼養(yǎng)，雌雄分開。給藥：2％吐溫-80溶液配制給藥用小檗堿、本發(fā)明化合物及二甲雙胍溶液,濃度為10mg.ml-1。給藥組大鼠按100mg.kg-1體重劑量灌胃對應(yīng)藥液10ml.kg-1,體重，對照組與模型組大鼠灌胃2％吐溫-80溶液10ml.kg-1體重,每天灌胃給藥1次，連續(xù)灌胃15天。動物實(shí)驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)動物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，室溫23±2℃，濕度50～60％，室內(nèi)照明和黑暗交替12h/d，每天換水1次，兩天換墊料1次，各組自由攝取飲水。實(shí)驗(yàn)大鼠血糖測定及降血糖功能評價：于各給藥組灌胃給藥當(dāng)天及給藥后第5、10、15天尾靜脈空腹取血，用血糖儀測定各組大鼠空腹血糖值，比較各組大鼠空腹血糖值及血糖下降百分率。血糖下降百分率＝(實(shí)驗(yàn)前血糖值-實(shí)驗(yàn)后血糖值)/實(shí)驗(yàn)前血糖值×100％。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有計(jì)量數(shù)據(jù)以“均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)偏差(x±s)”表示，標(biāo)準(zhǔn)偏差按“n-1”方法計(jì)算,多組樣本均數(shù)的比較，采用單因素方差分析，p<0.05判斷差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01判斷差別具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過計(jì)算分析，本發(fā)明化合物與黃連素及二甲雙胍相比，p<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有差異，說明本發(fā)明化合物的降糖效果優(yōu)于單用黃連素及二甲雙胍。實(shí)施例13本發(fā)明所述化合物的降脂作用效果試驗(yàn)以高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖金黃地鼠為受試對象，給予本發(fā)明化合物后，檢測體重，肝重，脂體比和血脂等指標(biāo)，通過觀察其減肥效果，進(jìn)而探討其降脂作用。(一)材料儀器：高速離心機(jī)，標(biāo)準(zhǔn)大鼠試驗(yàn)籠，電子秤；藥品與試劑：本發(fā)明化合物，奧里司他，甘油三酯試劑盒，hdl-c試劑盒，ldl-c試劑盒。動物：雄性金黃地鼠60只，(二)實(shí)驗(yàn)方法動物造模與分組：60只雄性金黃地鼠給予基礎(chǔ)飼料適應(yīng)喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)選取10只作為正常對照組，剩余的讓其自由采食高脂飼料(組成：10％豬油，10％蛋黃粉，1％膽固醇，79％基礎(chǔ)飼料)。喂養(yǎng)四周后，空腹禁食不禁水12h，眼眶后取靜脈血，測定其體重，tc，tg，ldl-c和hdl-c。將造模成功的金黃地鼠隨機(jī)分為5組(n＝10)：模型組，奧利司他組，本發(fā)明化合物低、中、高劑量組，藥物干預(yù)4周，正常對照組和模型組每天灌胃等體積生理鹽水，奧里斯他組每天給藥42mg/kg，本發(fā)明化合物低、中、高劑量分別按每天23.35、46.70、70.05mg/kg給藥，金黃地鼠自由攝食，飲水；光照節(jié)律12l，12d(7:00-19:00)，室溫(24±2)℃，濕度：(55±10)％。(三)指標(biāo)測定1、體重、體長和剩食量測定：在試驗(yàn)期間，各組動物均采取單籠飼養(yǎng)并自由攝食，飲水。每3天測定一次體重(灌胃給藥前稱重)和剩食量，并記錄結(jié)果。處死前麻醉狀態(tài)下測定其體長(鼻至肛門的長度)、腰圍，按公式[lee，s＝(體重)-(1/3)×103/體長(cm)]計(jì)算lee，s指數(shù)。2、血清tc、tg、ldl-c、hdl-c測定：取血前，空腹禁食不禁水12h,用玻璃毛細(xì)管于眼眶后靜脈取血，禁食2h后，5000r/min離心10min，取上清液，-20℃保存，采用生化試劑盒測定血清中tc、tg、ldl-c、hdl-c。3、肝重、睪丸及腎周脂肪測定：剖取肝臟、腎周圍脂肪和睪丸周圍的全部脂肪并稱重，計(jì)算脂肪/體重的比值(脂體比)。(四)數(shù)據(jù)處理以spss17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算數(shù)據(jù)以“均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以用藥四周后本發(fā)明化合物組及陽性對照物使高脂血組小鼠tc、tg、ldl-c、hdl-c下降的百分率為例來初步探究該藥物的降脂作用。本發(fā)明化合物與黃連素及姜黃素相比(p<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而三者與陽性對照藥奧里司他相比(p<0.01)，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即本發(fā)明化合物的降脂作用優(yōu)于單用的黃連素或二甲雙胍，但不及陽性對照藥奧利司他。實(shí)施例14本發(fā)明所述化合物對心腦血管疾病的作用效果試驗(yàn)通過探討本發(fā)明化合物對apoe(-/-)小鼠早期動脈粥樣硬化的作用(主要通過觀察對該鼠右頸總動脈外膜炎癥、硬化血管膠原及彈力板的影響)，來研究本發(fā)明化合物在心腦血管疾病方面的作用。(一)材料與方法1、儀器與器材(1)tissue-tekii旋轉(zhuǎn)式自動脫水機(jī):日本櫻花公司(2)tissue-tek,tecs組織包埋機(jī):日本櫻花公司(3)冰凍切片機(jī):德國leica公司(4)超低溫冰箱:日本三洋公司(5)普通光學(xué)顯微鏡:日本nikon公司(6)偏振光顯微鏡:日本olympus公司(7)熒光顯微鏡:日本nikon公司(8)imagepro-plus6.0圖像分析軟件:美國macromedia公司(9)數(shù)據(jù)采集及分析系統(tǒng)spss17.0:美國powerlab公司(10)7600自動分析儀:日本日立公司2、藥物與試劑(1)本發(fā)明化合物(自制)；(2)阿托伐他?。汉贾菽硸|制藥有限公司；(3)生理鹽水注射液：北京雙鶴藥業(yè)有限公司；(4)異戊巴比妥鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；(5)蘇木素-伊紅生物染色劑：北京化工廠；(6)磷酸鹽緩沖液(phosphate-bufferedsaline，pbs，0.01m，ph7.4)：稱取8gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4，溶于800ml蒸餾水中，用hci調(diào)節(jié)溶液ph值至7.4，最后加蒸餾水定溶至il；(7)4％多聚甲醛液:稱取409多聚甲醛，置于燒瓶中，加入800ml0.lmol/l磷酸緩沖液，加熱至60℃，磁力攪拌使粉末完全溶解，最后補(bǔ)足0.lmol/l的pb至1000ml，充分混勻；(8)苦味酸天狼猩紅染色液：0.1g天狼猩紅，溶解于100ml苦味酸飽和液中。(9)維多利亞藍(lán)染色液：維多利亞藍(lán)2g、糊精0.50g、間苯二酚4g，蒸餾水200ml，將上述混合煮沸5min,再將已煮沸的30％三氯化鐵液加入上液中，繼續(xù)煮沸2min，此時不斷攪拌呈膠體狀,去火冷卻過濾后，把紙上的殘?jiān)旁?0℃恒溫箱中烤干，最后把干殘?jiān)苡?00ml的75％酒精中,再加入濃鹽酸5ml和苯酚5g，置室溫備用；(10)羅丹明標(biāo)記的羊抗兔igg:北京中杉金橋生物技術(shù)公司；(11)熒光防淬滅劑:北京中杉金橋生物技術(shù)公司。(二)實(shí)驗(yàn)動物及分組以c57bl/6為遺傳背景的6周齡雄性apoe(-/-)小鼠20只，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部。飼養(yǎng)于符合二級動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所動物室。室內(nèi)凈化空氣流動換氣，保持室溫22℃～25℃，濕度50％左右，明暗周期12小時(7am-7pm)。小鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中，鼠籠、飲水瓶、墊料均經(jīng)高壓消毒。小鼠自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)6天后，飼以含豬油21％、膽固醇1.25％和普通混合飼料粉77.75％的高脂飼料(60鉆滅菌照射處理)。實(shí)驗(yàn)動物操作過程嚴(yán)格遵照北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院及中日友好醫(yī)院倫理委員會的規(guī)程進(jìn)行，對動物的處理符合動物保護(hù)倫理道德。將小鼠隨機(jī)分為4組，空白對照組、二甲雙胍大、中、小劑量組，每組各5只，觀察給藥后不同劑量組對apoe(-/-)小鼠早期動脈粥樣硬化的影響。給藥方法：根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》(徐叔云主編，2002年第三版，人民衛(wèi)生出版社)中的人與小鼠用藥劑量換算公式，按體重對實(shí)驗(yàn)藥物劑量進(jìn)行換算。根據(jù)成人每日用藥臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體重折算系數(shù)9.01折算成小鼠用量，阿托伐他汀組給予阿托伐他汀3mg/kg/d，空白本發(fā)明化合物組給予生理鹽水0.2ml/kg/d，本發(fā)明化合物組給予本發(fā)明化合物大劑量組240mg/kg/d、中劑量組160mg/kg/d、小劑量組80mg/kg/d以灌胃的方式給藥，持續(xù)4周。1、本發(fā)明化合物對ap0e(-/-)小鼠早期動脈粥樣硬化右頸總動脈外膜炎癥的影響取材與切片(1)取材：實(shí)驗(yàn)小鼠禁食12h后，以1％異戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，將其仰臥，頭部及四肢固定于手術(shù)臺上，酒精消毒后，縱形切開腹胸及頸部皮膚，逐層分離，剪開橫隔，暴露心臟，下腔靜脈取血后，以0.9％的生理鹽水由左心室進(jìn)行灌注，待血液沖洗干凈后，暴露右頸總動脈鞘，游離出右頸總動脈，長約1cm，用冰生理鹽水將其沖洗,濾紙吸干后，放在一涂有oct冰凍切片包埋劑的直徑為3cm的小圓形硬紙板上，并將oc丁涂在整個標(biāo)本上，放在已有液氮預(yù)冷約1min的盛有異戊烷的小燒杯內(nèi)冷凍成固態(tài)，后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?2)切片:從右頸總動脈近端下方開始以6μm的厚度連續(xù)橫切，每50μm留取1張切片，將其置于載玻片上，每只小鼠取8張切片。病理學(xué)檢驗(yàn)及分析:冰凍切片行蘇木素-伊紅(he)染色，在高倍鏡下觀察血管周圍炎性細(xì)胞的浸潤情況。觀察范圍為小鼠右頸總動脈及周圍的間質(zhì)組織,由于所染色的切面、顯露的血管長度不同，觀察到的面積也各不相同，加之樣本炎細(xì)胞分布疏密程度有很大差別，為統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，我們都選取每一支被觀察血管炎細(xì)胞分布密集的區(qū)域，每張切片在leica全自動圖像分析系統(tǒng)上隨機(jī)計(jì)算8個400倍物鏡視野中陽性細(xì)胞總數(shù)作為該樣本的統(tǒng)計(jì)數(shù)值。冰凍切片he染色步驟：①冰凍切片，室溫下恢復(fù)20min；②切片入harris蘇木素15min；③流水沖洗5min；④0.5％鹽酸酒精分化30s；⑤流水沖洗5min；⑥伊紅染色10min；⑦流水沖洗5min；⑧梯度酒精脫水；⑨二甲苯透明15min×2次，中勝封片。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用spssl7.0軟件，劑量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組比較采用單因素方差分析(one-wayanova)，組間兩兩比較采用lsd，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以大劑量組時，本發(fā)明化合物組及陽性對照藥對小鼠右頸總動脈外膜炎癥細(xì)胞個數(shù)的影響，來比較該藥物對ap0e(-/-)小鼠早期動脈粥樣硬化右頸總動脈外膜炎癥的影響，進(jìn)而探討其在心腦血管疾病方面的作用。組別阿托伐他汀本發(fā)明化合物黃連素二甲雙胍炎癥細(xì)胞數(shù)(個)5±225±329±335±2結(jié)果表明：本發(fā)明化合物與黃連素及二甲雙胍相比(p<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明本發(fā)明化合物對小鼠右頸總動脈外膜炎癥的抑制作用優(yōu)于黃連素或二甲雙胍。2、本發(fā)明化合物對ap0e(-/-)小鼠早期動脈粥樣硬化血管膠原及彈力板的影響實(shí)驗(yàn)動物，喂養(yǎng)分組，取材與切片同對ap0e(-/-)小鼠早期動脈粥樣硬化右頸總動脈外膜炎癥實(shí)驗(yàn)相同。病理學(xué)檢驗(yàn)及分析：冰凍切片天狠猩紅套染維多利亞藍(lán)染色，冰凍切片天狼猩紅染色選取切片以0.1％苦味酸天狼猩紅染液染色，以評估i型和111型膠原。每只小鼠留取8張切片，這8張切片的膠原含量平均值代表每只小鼠的右頸總動脈膠原含量值?？辔端崽炖切杉t染色步驟：(1)冰凍切片室溫下恢復(fù)20min；(2)移入二甲苯和純酒精(1:1)混合液中5min左右；(3)入100％、95％、85％、70％酒精，各級為5min；(4)蒸餾水洗3次；(5)以苦味酸天狼猩紅染液染60min；(6)無水酒精直接分化與脫水；(7)二甲苯透明，中性樹膠封片。冰凍切片維多利亞藍(lán)染色：選取切片以維多利亞藍(lán)染液染色，以評估彈力纖維分級及內(nèi)中膜厚度。每只小鼠留取8張切片，這8張切片的彈力纖維分級及其中膜厚度平均值代表每只小鼠的右頸總動脈彈力纖維分級及內(nèi)中膜厚度的值。維多利亞藍(lán)染色步驟：(l)冰凍切片室溫下恢復(fù)20min；(2)切片入75％酒精中洗1min；(3)在維多利亞藍(lán)染色液中30min左右；(4)直接用95％酒精分色數(shù)秒鐘；(5)用蒸餾水洗三次，(6)二甲苯透明，中性樹膠封固。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用spssl7.0軟件，劑量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析(one-wayanova)，組間兩兩比較采用lsd，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以大劑量組時，本發(fā)明化合物組及陽性對照組對小鼠ⅰ型、ⅲ型膠原含量(％)及彈力纖維ⅰ級病率(％)的影響來考察該藥物對ap0e(-/-)小鼠早期動脈粥樣硬化血管膠原及彈力板的影響。組別阿托伐他汀本發(fā)明化合物黃連素二甲雙胍ⅰ型膠原含量(％)21.52±1.6349.24±2.1659.42±3.1765.43±1.70ⅲ型膠原含量(％)4.53±2.3139.51±2.8242.35±1.5349.35±2.72彈力纖維ⅰ級病(％)60.48±1.5226.36±2.1814.30±1.8512.65±2.34結(jié)果表明：以ⅰ型、ⅲ型膠原含量(％)及彈力纖維ⅰ級病率(％)為對照參數(shù)，本發(fā)明化合物與黃連素及二甲雙胍比較(p<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而三者與陽性對照組比較(p<0.01)，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，進(jìn)而表明本發(fā)明化合物對ap0e(-/-)小鼠早期動脈粥樣硬化血管膠原及彈力板的影響優(yōu)于單用黃連素或姜黃素，但不及陽性對照藥。最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。當(dāng)前第1頁12