本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種豬松弛素的提取純化方法，更具體地涉及一種從豬卵巢中采用丙酮梯度抽提，離子交換層析和疏水層析技術(shù)分離純化豬松弛素的方法。

背景技術(shù)：

松弛素是一種對母畜分娩前產(chǎn)道有松弛作用的多肽類激素，主要產(chǎn)生于哺乳動物妊娠期間卵巢中的黃體，其最初作為一種與哺乳動物生殖活動有關(guān)的多肽激素被發(fā)現(xiàn)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)松弛素具有更廣泛的生物學(xué)功能：如抑制膠原的形成與促進膠原酶合成，從而促進膠原的降解，在分娩時軟化生殖道組織，抑制子宮收縮，促進骨盆韌帶軟化，刺激乳腺生長與分化；能夠刺激多種器官與組織的血管擴張，抑制血小板凝集；刺激胰島細胞分泌胰島素，調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖；促進潰瘍組織愈合；影響垂體激素分泌。

由此可見，松弛素具有復(fù)雜的生物學(xué)作用和廣闊的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。目前國外已有報道，Connetics公司已將松弛素用于全身性硬皮病的治療當(dāng)中，并已完成了Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗。而國內(nèi)在此方面的研究甚少。

松弛素已從許多種生物中被提純，包括豬、鼠、馬、鯊、虎、大鼠、角鯊及人類。然而，如何獲得高純度的松弛素仍然是一個值得研究的課題。松弛素在動物體內(nèi)含量低，且穩(wěn)定性差，提取純化難度高。高純度松弛素需從卵巢組織中抽提出含有松弛素的粗品蛋白，再去除幾乎所有的雜蛋白，其純化工藝存在許多難點。如J.Doczi采用鹽酸丙酮抽提，氯化鋅鹽析的方法，得到的松弛素純度不高，并且高濃度的氯化鋅對松弛素活性也有影響(O.D.Sherwood，Isolation and Characterization of Porcine and Rat Relaxin，Advances in Experimental Medicine and Biology pp 115-138，1982,DOL 10.1007/978-1-4613-3368-55)。C.David Sherwood等人采用鹽酸丙酮抽提、分子篩層析和離子交換層析的方法，得到了較高純度的松弛素(C.D.SHERWOOD et al,Purification and characterization ofporcine relaxin,Chemical Abstracts Band 80,Nr.13,1.April 1974,Columbus,Ohio,USA)。但該法在分子篩層析過程中損失很大，并且不利于大規(guī)模生產(chǎn)；在離子交換洗脫后，存在相似電荷特性的雜蛋白，影響最終產(chǎn)品的純度。后來采用的陽離子交換層析和陰離子交換層析結(jié)合的技術(shù)雖能制備純度合適的樣品，但是由于陰離子交換層析在吸附和洗脫時采用的高pH條件，會嚴重破壞松弛素的生物活性。

另外CN 102603888A公開了一種采用畢赤酵母菌制備人類松弛素-2的方法，其中從發(fā)酵液提取純化人類松弛素-2需要反復(fù)進行數(shù)次微孔濾膜過濾，且需要3次色譜柱分離純化操作，耗時較長。CN 103788207A公開了一種從發(fā)酵液中提取純化人類松弛素-2的方法，該方法包括將發(fā)酵液離心后過截流分子量3000的醋酸纖維素超濾膜過濾，依次上SephadexG-50柱和SynchropakRP-PC18反相HPLC層析柱進行層析純化，然后通過低溫旋蒸濃縮，冷凍干燥，得純化的人類松弛素-2。該方法原料昂貴，不易獲得，且難以保存松弛素結(jié)構(gòu)和生物活性的完整。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種豬松弛素的提取純化方法。本發(fā)明的方法制備的松弛素不僅收率高、純度高、產(chǎn)量大，而且所得松弛素的結(jié)構(gòu)和生物活性保存完整。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種豬松弛素的提取純化方法，包括如下步驟：

(1)丙酮梯度抽提制備松弛素粗品；

(2)陽離子交換層析；

(3)疏水層析；

(4)冷凍干燥；

其中，步驟(1)的過程包括：將豬卵巢依次用鹽酸、丙酮提取，所得提取液加入丙酮后低溫處理，處理后所得沉淀經(jīng)丙酮脫水后干燥得到松弛素粗品；低溫例如可以為-10℃--40℃，例如-15℃、-19℃、-21℃、-26℃、-30℃、-35℃、-38℃等；

將豬卵巢依次用鹽酸、丙酮提取時所述丙酮與豬卵巢的量的比為1-5L/kg，例如為1.3L/kg、1.8L/kg、2.5L/kg、2.9L/kg、3.3L/kg、3.7L/kg、4.1L/kg、4.6L/kg、4.9L/kg等；

提取液加入丙酮后低溫處理時所述丙酮的體積為所述提取液的1-10倍，例如為1.5倍、2.3倍、3.0倍、3.5倍、5.0倍、7.0倍、8.5倍、9.0倍、9.7倍等。

本發(fā)明的提取純化方法利用酸性有機溶劑梯度，低濃度有機溶劑中溶解，高濃度有機溶劑中沉淀出來，對松弛素抽提制備粗品，低pH值的酸性有機溶劑不僅能夠保持松弛素不受組織蛋白酶的破壞，還能夠保護松弛素特有的二硫鍵結(jié)構(gòu)；而且通過控制有機溶劑梯度，可以較精準的去除卵巢中的大部分雜蛋白和脂類物質(zhì)；另外采用陽離子交換層析和疏水層析可最大限度去除松弛素以外的雜蛋白，并且保存松弛素結(jié)構(gòu)和生物活性的完整。

作為優(yōu)選，步驟(1)的過程包括：

(a)將冰凍的豬卵巢處理為小塊，加入0-10℃，例如1.5℃、2.6℃、4℃、6℃、7.5℃、8.7℃、9.5℃等的鹽酸，0-10℃下攪拌抽提1-5小時，再加入0-10℃，例如1.5℃、2.6℃、4℃、6℃、7.5℃、8.7℃、9.5℃等的丙酮，0-10℃下攪拌抽提2-10小時，靜置5小時以上，優(yōu)選10小時；

(b)將步驟(a)所得抽提溶液0-10℃下離心；

(c)取步驟(b)所得上清液加入-10℃--40℃，例如-15℃、-19℃、-21℃、-26℃、-30℃、-35℃、-38℃等的丙酮，攪拌后置0-10℃低溫操作間10小時以上，優(yōu)選為24小時；

(d)將步驟(c)所得底部沉淀0-10℃下離心，然后沉淀經(jīng)丙酮脫水后干燥即得所述松弛素粗品。

作為優(yōu)選，步驟(a)中所述豬卵巢經(jīng)絞碎處理。

優(yōu)選地，所述鹽酸與豬卵巢的量的比為0.1-1L/kg，優(yōu)選為0.3-0.5L/kg。

優(yōu)選地，所述丙酮與豬卵巢的量的比為1-5L/kg，優(yōu)選為2-2.5L/kg。

優(yōu)選地，所述鹽酸的濃度為0.5-5mol/L，優(yōu)選為1.5mol/L。

優(yōu)選地，所述攪拌抽提的溫度為4-8℃。

作為優(yōu)選，步驟(b)中所述離心的轉(zhuǎn)速為3000rpm，離心的時間為5分鐘以上，優(yōu)選為10分鐘。

作為優(yōu)選，步驟(c)中所述丙酮的體積為所述上清液的1-10倍，優(yōu)選為4倍。

優(yōu)選地，所述攪拌的時間為2分鐘以上，優(yōu)選為5分鐘。

作為優(yōu)選，步驟(d)中所述離心的轉(zhuǎn)速為4000rpm，離心的時間為5分鐘以上，優(yōu)選為10分鐘。

作為優(yōu)選，步驟(2)的過程包括：將步驟(1)所得松弛素粗品溶解于平衡緩沖液中，離心后取上清液過濾，調(diào)節(jié)過濾液pH值和電導(dǎo)率值與平衡緩沖液一致，然后將過濾液上層析柱；上樣完畢后，用洗滌緩沖液沖洗層析柱，再用洗脫液洗脫目的蛋白，收集洗脫液。

優(yōu)選地，所述平衡緩沖液為NH₄Ac，pH為4-6.5，優(yōu)選為5.0-6.0。

優(yōu)選地，所述平衡緩沖液為0.03-0.08mol/L的NH₄Ac，優(yōu)選為0.05mol/L的NH₄Ac。

優(yōu)選地，所述松弛素粗品與平衡緩沖液的比例為1:10-20g/mL，例如為1:12g/mL、1:15g/mL、1:18g/mL等。

優(yōu)選地，所述洗滌緩沖液為0.03-0.08mol/L NH₄Ac與0.01-0.05mol/L NaCl的混合液，優(yōu)選為0.05mol/LNH₄Ac與0.01-0.05mol/LNaCl的混合液。

優(yōu)選地，所述洗脫液為0.03-0.08mol/LNH₄Ac與0.1-0.3mol/LNaCl的混合液，優(yōu)選為0.05mol/LNH₄Ac與0.1-0.3mol/LNaCl的混合液。

優(yōu)選地，所述層析柱的層析介質(zhì)為CM-Sepharose FF凝膠。

作為優(yōu)選，步驟(3)的過程包括：向步驟(2)收集得洗脫液中加入平衡緩沖液，離心，取上清液過濾，然后將過濾液上層析柱；上樣完畢后，用洗滌緩沖液沖洗層析柱，再用洗脫液洗脫目的蛋白，收集洗脫液。

優(yōu)選地，所述平衡緩沖液為NH₄Ac與NaCl的混合液，pH為4-6.5，優(yōu)選為5.0-6.0。

優(yōu)選地，所述平衡緩沖液為0.02-0.08mol/LNH₄Ac與3mol/LNaCl的混合液，優(yōu)選為0.05mol/LNH₄Ac與3mol/LNaCl的混合液。

優(yōu)選地，所述洗滌緩沖液為0.03-0.08mol/LNH₄Ac與0.5-3mol/LNaCl的混合液，優(yōu)選為0.05mol/LNH₄Ac與1-1.5mol/LNaCl的混合液。

優(yōu)選地，所述洗脫液為0.03-0.08mol/LNH₄Ac與0.2-2mol/LNaCl的混合液，優(yōu)選為0.05mol/LNH₄Ac與0.5-0.8mol/LNaCl的混合液。

優(yōu)選地，所述層析柱的層析介質(zhì)為Phenyl-sepharose FF凝膠。

作為優(yōu)選，步驟(4)的過程包括：將步驟(3)收集的洗脫液經(jīng)超濾膜超濾，然后加入醋酸溶液，至超濾濾出液的電導(dǎo)不高于所加醋酸溶液的電導(dǎo)，然后將濾出液冷凍干燥，也可以將濾出液濃縮后冷凍干燥。

優(yōu)選地，所述超濾膜為2-10kd，優(yōu)選為5kd。

優(yōu)選地，所述醋酸溶液的濃度為0.05-0.2mol/L，優(yōu)選為0.1mol/L。

作為優(yōu)選，本發(fā)明的提取純化方法包括如下步驟：

(1)丙酮梯度抽提制備松弛素粗品

將冰凍的豬卵巢絞碎，加入4℃的1.5mol/L鹽酸，4-8℃下攪拌抽提3小時，再加入4℃的丙酮，4-8℃下攪拌抽提5小時，靜置10小時；抽提溶液4℃離心，離心轉(zhuǎn)速為3000rpm，離心時間10分鐘；取離心上清液加入4倍體積的-20℃的丙酮，并不斷攪拌5分鐘，置4-8℃低溫操作間24小時，虹吸上清液，取底部沉淀4℃離心，離心轉(zhuǎn)速為4000rpm，離心時間10分鐘，沉淀經(jīng)丙酮脫水真空干燥制備松弛素粗品；

(2)陽離子交換層析

將步驟(1)所得松弛素粗品溶解于平衡緩沖液中，離心，取上清液過濾，調(diào)節(jié)過濾液pH值和電導(dǎo)率值與平衡緩沖液一致，上層析柱；上樣完畢后，用洗滌緩沖液沖洗層析柱，再用洗脫液洗脫目的蛋白，收集洗脫液；

所述平衡緩沖液為0.05mol/L的NH₄Ac，pH為5.0-6.0；

所述洗滌緩沖液為0.05mol/LNH₄Ac與0.01-0.05mol/LNaCl的混合液；

所述洗脫液為0.05mol/LNH₄Ac與0.1-0.3mol/LNaCl的混合液；

所述層析柱的層析介質(zhì)為CM-Sepharose FF凝膠；

(3)疏水層析

向步驟(2)收集的洗脫液中加入平衡緩沖液，離心，取上清液過濾，將過濾液上層析柱；上樣完畢后，用洗滌緩沖液沖洗層析柱，再用洗脫液洗脫目的蛋白，收集洗脫液；

所述平衡緩沖液為0.05mol/LNH₄Ac與3mol/LNaCl的混合液，pH為5.0-6.0；

所述洗滌緩沖液為0.05mol/LNH₄Ac與1-1.5mol/LNaCl的混合液；

所述洗脫液為0.05mol/LNH₄Ac與0.5-0.8mol/LNaCl的混合液；

所述層析柱的層析介質(zhì)為Phenyl-sepharose FF凝膠；

(4)冷凍干燥

將步驟(3)收集的洗脫液經(jīng)5kd超濾膜超濾，并不斷添加0.1mol/L醋酸溶液，至超濾濾出液電導(dǎo)等于0.1mol/L醋酸溶液，取超濾后的濃縮液冷凍干燥。

本發(fā)明方法中抽提和層析過程優(yōu)選在4-8℃低溫操作間進行，所用純化水和配制溶液優(yōu)選均提前預(yù)冷至4-8℃，所用醋酸銨，氯化鈉，冰醋酸，鹽酸為分析純，丙酮可為工業(yè)級。

本發(fā)明的方法不僅能夠保持松弛素不受組織蛋白酶的破壞，還能夠保護松弛素特有的二硫鍵結(jié)構(gòu)；可以較精準且最大限度去除松弛素以外的雜蛋白和脂類物質(zhì)，并且保存松弛素結(jié)構(gòu)和生物活性的完整。同時本發(fā)明的方法制備產(chǎn)品收率高、純度高、產(chǎn)量大，較好的解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點。

附圖說明

圖1為B鏈29氨基酸的豬松弛素標準品的分子篩HPLC圖譜；

圖2為實施例1所得產(chǎn)品的分子篩HPLC圖譜；

圖3為考馬斯亮藍電泳和Westernblot電泳圖譜；

圖4為實施例2所得產(chǎn)品的分子篩HPLC圖譜。

具體實施方式

為便于理解本發(fā)明，本發(fā)明列舉實施例如下。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實施例僅僅用于幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。

實施例1

一種豬松弛素的提取純化方法，包括如下步驟：

(1)將10.2kg冰凍的豬卵巢絞碎，加入事先預(yù)冷為4℃的1.5mol/L鹽酸5L，4℃下攪拌抽提3小時，再加入4℃的丙酮25L，4℃下攪拌抽提5小時，靜置10小時；抽提溶液4℃離心，離心轉(zhuǎn)速為3000rpm，離心時間10分鐘；取離心上清液加入4倍體積的-20℃的丙酮，并不斷攪拌5分鐘，置8℃低溫操作間24小時，虹吸上清液，取底部沉淀4℃離心，離心轉(zhuǎn)速為4000rpm，離心時間10分鐘，沉淀經(jīng)丙酮脫水真空干燥制備松弛素粗品102g；

(2)將步驟(1)所得松弛素粗品102g溶解于2.0L平衡緩沖液(0.05mol/L NH₄Ac，pH 5.0-6.0)中，離心后取上清液過濾，調(diào)節(jié)過濾液pH值和電導(dǎo)率值與平衡緩沖液一致，然后將過濾液上CM-Sepharose FF凝膠層析柱；上樣完畢后，用洗滌緩沖液(0.05mol/L NH₄Ac，0.01mol/L NaCl)沖洗層析柱，再用洗脫液(0.05mol/L NH₄Ac，0.3mol/L NaCl)洗脫目的蛋白，收集洗脫液；

(3)向步驟(2)收集得洗脫液中加入平衡緩沖液(0.05mol/L NH₄Ac，3mol/L NaCl，pH 5.0-6.0)，離心，取上清液過濾，然后將過濾液上Phenyl-sepharose FF凝膠層析柱；上樣完畢后，用洗滌緩沖液(0.05mol/L NH₄Ac，1mol/L NaCl)沖洗層析柱，再用洗脫液(0.05mol/L NH₄Ac，0.8mol/L NaCl)洗脫目的蛋白，收集洗脫液；

(4)將步驟(3)收集的洗脫液經(jīng)5kd超濾膜超濾，并不斷添加0.1mol/L醋酸溶液，至超濾濾出液電導(dǎo)等于0.1mol/L醋酸溶液，取超濾后的濃縮液冷凍干燥制備松弛素純品2.05g，批號090502。

將本實施例制得產(chǎn)品經(jīng)分子篩HPLC圖譜顯示含量為95.2％，出峰時間與B鏈29氨基酸標準品圖譜一致，標準品圖譜見圖1，本實施例產(chǎn)品的圖譜見圖2。

本實施例產(chǎn)品的收率為0.02％，遠高于C.David Sherwood的0.01％(C.D.SHERWOOD et al,Purification and characterization ofporcine relaxin,Chemical Abstracts Band 80,Nr.13,1.April 1974,Columbus,Ohio,USA)，達到了國際領(lǐng)先水平。

考馬斯亮藍電泳非還原樣品為單一條帶，還原后樣品呈現(xiàn)兩條條帶，western-blot電泳與松弛素抗特異性結(jié)合明顯，表明松弛素結(jié)構(gòu)和生物活性保持完整，見圖3。

其中B鏈29氨基酸標準品購買自Sigma公司，含量為99.5％；western-blot兔抗豬松弛素多抗購買自Sigma公司。

實施例2

一種豬松弛素的提取純化方法，包括如下步驟：

(1)將10kg冰凍的豬卵巢絞碎，加入事先預(yù)冷為4℃的1.5mol/L鹽酸3L，8℃下攪拌抽提3小時，再加入4℃的丙酮20L，8℃下攪拌抽提5小時，靜置10小時；抽提溶液4℃離心，離心轉(zhuǎn)速為3000rpm，離心時間10分鐘；取離心上清液加入4倍體積的-20℃的丙酮，并不斷攪拌5分鐘，置4℃低溫操作間24小時，虹吸上清液，取底部沉淀4℃離心，離心轉(zhuǎn)速為4000rpm，離心時間10分鐘，沉淀經(jīng)丙酮脫水真空干燥制備松弛素粗品95g；

(2)將步驟(1)所得松弛素粗品95g溶解于1.0L平衡緩沖液(0.05mol/L NH₄Ac，pH 5.0-6.0)中，離心后取上清液過濾，調(diào)節(jié)過濾液pH值和電導(dǎo)率值與平衡緩沖液一致，然后將過濾液上CM-Sepharose FF凝膠層析柱；上樣完畢后，用洗滌緩沖液(0.05mol/L NH₄Ac，0.05mol/L NaCl)沖洗層析柱，再用洗脫液(0.05mol/L NH₄Ac，0.1mol/L NaCl)洗脫目的蛋白，收集洗脫液；

(3)向步驟(2)收集得洗脫液中加入平衡緩沖液(0.05mol/L NH₄Ac，3mol/L NaCl，pH 5.0-6.0)，離心，取上清液過濾，然后將過濾液上Phenyl-sepharose FF凝膠層析柱；上樣完畢后，用洗滌緩沖液(0.05mol/L NH₄Ac，1.1mol/L NaCl)沖洗層析柱，再用洗脫液(0.05mol/L NH₄Ac，0.5mol/L NaCl)洗脫目的蛋白，收集洗脫液；

(4)將步驟(3)收集的洗脫液經(jīng)5kd超濾膜超濾，并不斷添加0.1mol/L醋酸溶液，至超濾濾出液電導(dǎo)等于0.1mol/L醋酸溶液，取超濾后的濃縮液冷凍干燥制備松弛素純品2.03g，批號090801。

將本實施例制得產(chǎn)品經(jīng)分子篩HPLC圖譜顯示含量為93.0％，出峰時間與B鏈29氨基酸標準圖譜一致見圖4，收率為0.0203％，考馬斯亮藍電泳和western-blot電泳均呈現(xiàn)典型松弛素特征，見圖3。

實施例3

一種豬松弛素的提取純化方法，包括如下步驟：

(1)將10.4kg冰凍的豬卵巢絞碎，加入事先預(yù)冷為2℃的4.5mol/L鹽酸1.2L，2℃下攪拌抽提5小時，再加入2℃的丙酮17L，2℃下攪拌抽提10小時，靜置5小時；抽提溶液2℃離心，離心轉(zhuǎn)速為3000rpm，離心時間5分鐘；取離心上清液加入8倍體積的-10℃的丙酮，并不斷攪拌3分鐘，置2℃低溫操作間10小時，虹吸上清液，取底部沉淀8℃離心，離心轉(zhuǎn)速為4000rpm，離心時間5分鐘，沉淀經(jīng)丙酮脫水真空干燥制備松弛素粗品108g；

(2)將步驟(1)所得松弛素粗品108g溶解于1.5L平衡緩沖液(0.08mol/L NH₄Ac，pH 5.0-6.0)中，離心后取上清液過濾，調(diào)節(jié)過濾液pH值和電導(dǎo)率值與平衡緩沖液一致，然后將過濾液上CM-Sepharose FF凝膠層析柱；上樣完畢后，用洗滌緩沖液(0.03mol/L NH₄Ac，0.01mol/L NaCl)沖洗層析柱，再用洗脫液(0.03mol/L NH₄Ac，0.3mol/L NaCl)洗脫目的蛋白，收集洗脫液；

(3)向步驟(2)收集得洗脫液中加入平衡緩沖液(0.02mol/L NH₄Ac，3mol/L NaCl，pH 5.0-6.0)，離心，取上清液過濾，然后將過濾液上Phenyl-sepharose FF凝膠層析柱；上樣完畢后，用洗滌緩沖液(0.08mol/L NH₄Ac，0.9mol/L NaCl)沖洗層析柱，再用洗脫液(0.03mol/L NH₄Ac，0.4mol/L NaCl)洗脫目的蛋白，收集洗脫液；

(4)將步驟(3)收集的洗脫液經(jīng)3kd超濾膜超濾，并不斷添加0.2mol/L醋酸溶液，至超濾濾出液電導(dǎo)等于0.2mol/L醋酸溶液，取超濾后的濃縮液冷凍干燥制備松弛素純品2.17g。

將本實施例制得產(chǎn)品經(jīng)分子篩HPLC圖譜顯示含量為94.3％，收率為0.0217％，考馬斯亮藍電泳和western-blot電泳均呈現(xiàn)典型松弛素特征。

實施例4

一種豬松弛素的提取純化方法，包括如下步驟：

(1)將9.9kg冰凍的豬卵巢絞碎，加入事先預(yù)冷為8℃的0.5mol/L鹽酸9L，8℃下攪拌抽提1小時，再加入8℃的丙酮45L，8℃下攪拌抽提2小時，靜置12小時；抽提溶液8℃離心，離心轉(zhuǎn)速為3000rpm，離心時間15分鐘；取離心上清液加入2倍體積的-10℃的丙酮，并不斷攪拌8分鐘，置8℃低溫操作間32小時，虹吸上清液，取底部沉淀2℃離心，離心轉(zhuǎn)速為4000rpm，離心時間15分鐘，沉淀經(jīng)丙酮脫水真空干燥制備松弛素粗品93g；

(2)將步驟(1)所得松弛素粗品93g溶解于1.8L平衡緩沖液(0.03mol/L NH₄Ac，pH 5.0-6.0)中，離心后取上清液過濾，調(diào)節(jié)過濾液pH值和電導(dǎo)率值與平衡緩沖液一致，然后將過濾液上CM-Sepharose FF凝膠層析柱；上樣完畢后，用洗滌緩沖液(0.08mol/L NH₄Ac，0.01mol/L NaCl)沖洗層析柱，再用洗脫液(0.08mol/L NH₄Ac，0.2mol/L NaCl)洗脫目的蛋白，收集洗脫液；

(3)向步驟(2)收集得洗脫液中加入平衡緩沖液(0.08mol/L NH₄Ac，3mol/L NaCl，pH 5.0-6.0)，離心，取上清液過濾，然后將過濾液上Phenyl-sepharose FF凝膠層析柱；上樣完畢后，用洗滌緩沖液(0.03mol/L NH₄Ac，1.2mol/L NaCl)沖洗層析柱，再用洗脫液(0.08mol/L NH₄Ac，0.7mol/L NaCl)洗脫目的蛋白，收集洗脫液；

(4)將步驟(3)收集的洗脫液經(jīng)3kd超濾膜超濾，并不斷添加0.05mol/L醋酸溶液，至超濾濾出液電導(dǎo)等于0.05mol/L醋酸溶液，取超濾后的濃縮液冷凍干燥制備松弛素純品2.00g。

將本實施例制得產(chǎn)品經(jīng)分子篩HPLC圖譜顯示含量為95.3％，收率為0.0200％，考馬斯亮藍電泳和western-blot電泳均呈現(xiàn)典型松弛素特征。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。