本發(fā)明屬細胞培養(yǎng)領域，尤其涉及一種維持小鼠上胚層干細胞自我更新狀態(tài)的培養(yǎng)方法。

背景技術：

干細胞是分離自早期胚胎的一類細胞，在體外培養(yǎng)條件下具有無限增殖(自我更新)的能力，同時還保持著分化為機體各種類型細胞的潛能(分化)，現(xiàn)已成為研究基因功能、篩選藥物和制造疾病動物模型的強有力工具之一，在再生醫(yī)學領域具有巨大的應用前景。

目前研究得最為廣泛的干細胞是小鼠胚胎干細胞(mouse Embryonic Stem Cells，mESCs)，這也是第一株在體外成功建立的干細胞系。其后，人胚胎干細胞(human Embryonic Stem Cells，hESCs)系也得以成功構建。小鼠與人ESCs雖然擁有一些共同的特征，但二者的生物學特性卻有諸多不同之處。值得關注的是，科學家們于2007年從小鼠著床后的囊胚中分離得到了一種新型的干細胞——上胚層干細胞(mouse Epiblast Stem Cells，mEpiSCs)。mEpiSCs與mESCs在生物學特性上存在較大差異，卻與hESCs具有許多相似之處。由于人源性，hESCs無法進行嵌合體實驗或其它涉及倫理道德問題的研究，而mEpiSCs則可充當相應空白領域的補充材料；對mEpiSCs的深入研究，可為hESCs提供有利的研究思路與方法，其本身也是對于整個干細胞領域探究深度與廣度的擴充，因而具有重要的科研價值與學術意義，相關成果有助于未來對于干細胞的安全應用。

開展各類研究的前提是對于實驗材料的獲取與維持。早期分離得到的mEpiSCs被培養(yǎng)在人工合成培養(yǎng)基(chemically defined medium，CDM)中，并加入細胞因子激活素A(Activin A)和成纖維細胞生長因子2(fibroblast grow factors-2，F(xiàn)GF2)來維持細胞的生長與自我更新狀態(tài)。在CDM/AF條件下培養(yǎng)的mEpiSCs雖然也能表達自我更新標志基因并維持40代以上，但細胞的生長速度比較緩慢，不能耐受單細胞消化，易凋亡，需使用手動切割的方法，以小團塊形式進行傳代，此種方法不僅對操作人員的要求較高，操作過程中也容易造成細胞的污染，因此，常規(guī)培養(yǎng)方法不僅耗時、費力，且傳代后的細胞存活力低、容易分化，大大地限制了其基礎和應用研究。

為了優(yōu)化小鼠上胚層干細胞的培養(yǎng)條件，現(xiàn)安徽大學干細胞與轉化醫(yī)學研究中心的葉守東博士通過一個小分子化合物庫，篩選出Wnt/β-catenin信號通路的一個小分子抑制劑IWR1能夠有效地提高mEpiSCs的自我更新能力，大大地改善了目前mEpiSCs的培養(yǎng)狀況。此外，通過查閱相關科研進展，發(fā)現(xiàn)ROCK激酶的抑制劑Y27632可以提高hESCs的存活率。鑒于hESCs與mEpiSCs之間生物學特征的相似性，遂也可以將Y27632應用于mEpiSCs的培養(yǎng)中。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件以10％FBS含量的DMEM培養(yǎng)基為基礎，加入Activin A、bFGF、IWR1以及Y27632這四種細胞因子或小分子化合物。在此種培養(yǎng)條件下，細胞可耐受膠原酶IV的消化處理，存活能力顯著提高，克隆形態(tài)均一，生長狀況良好，可多次傳代，不出現(xiàn)分化現(xiàn)象。

雖然優(yōu)化后的Activin A+bFGF+IWR1+Y27632培養(yǎng)條件可以維持mEpiSCs的生長與自我更新狀態(tài)，但由于所涉及的細胞因子種類過多，不利于后續(xù)對于細胞內相關信號通路與分子機制的深入探究，且培養(yǎng)成本高。本發(fā)明在此基礎上，通過逐個遞減與對不同排列組合的嘗試，進一步改進與優(yōu)化mEpiSCs的培養(yǎng)條件，優(yōu)化后的條件僅使用兩種小分子即可維持mEpiSCs的自我更新狀態(tài)，達到與原培養(yǎng)條件相同的培養(yǎng)效果，具有省時、省力、省錢、利于后續(xù)研究等優(yōu)點。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決傳統(tǒng)培養(yǎng)條件中出現(xiàn)的細胞狀態(tài)不穩(wěn)定、傳代操作不方便以及現(xiàn)有培養(yǎng)條件成本高、作用因子復雜和不利于后續(xù)探究等問題，本發(fā)明提供了一種經濟高效、操作便捷、效果穩(wěn)定、利于開展后期研究的小鼠上胚層干細胞培養(yǎng)條件。

上述目的通過以下方案實現(xiàn)：

本發(fā)明的技術方案是在含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基基礎上，通過加入IWR1和Y27632兩種小分子化合物來維持小鼠上胚層干細胞的自我更新狀態(tài)。

一種維持小鼠上胚層干細胞自我更新狀態(tài)的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)小鼠上胚層干細胞的獲??；

(2)小鼠上胚層干細胞在IWR1+Y27632條件下的傳代和培養(yǎng)；

a、取1.4-1.6ml、0.09-0.11％濃度的明膠加入34-36mm BD Falcon細胞培養(yǎng)皿，置于36-38℃、4.5-5.5％CO₂濃度的細胞培養(yǎng)箱內，包被0.8-1.2h；

b、取生長至70-80％密度的上胚層干細胞，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞1次，以除去殘留的培養(yǎng)液；

c、加入0.8-1.2ml 0.09-0.1％濃度的膠原酶Ⅳ消化細胞，4.5-5.5min左右，細胞邊緣浮起，用移液器吹打，轉移至14-16ml Eppendorf離心管中，加入2.8-3.2ml DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)吹打，使之混勻而終止消化；

d、900-1100rpm離心2.8-3.2min后，吸去上清，加入2.8-3.2ml培養(yǎng)液重懸細胞；

e、重復步驟d；

f、900-1100rpm，離心2.8-3.2min，吸去上清后，加入適量培養(yǎng)液重懸細胞，在顯微鏡下利用血球計數板對懸液中的細胞進行計數，并以此計算出細胞的密度；

g、取步驟a已包被好的培養(yǎng)皿，棄明膠，向培養(yǎng)皿孔內加入1.8-2.2ml DMEM培養(yǎng)基，其中含有：9-11％FBS，0.9-1.1％MEM非必須氨基酸，1.9-2.1mM L-Glutamin，0.09-0.1Mmβ-巰基乙醇，0.9-1.1mM丙酮酸鈉，90-110單位的青霉素和90-110μg的鏈霉素；

h、向培養(yǎng)基中加入1.9×10⁴-2.1×10⁴個細胞，水平十字形晃動，使細胞分布均勻；

i、依次添加3.9-4.1μM IWR1和0.9-1.1μM Y27632，水平十字形晃動，使其混合均勻；

j、將細胞培養(yǎng)皿置于36-38℃、4-6％CO₂濃度的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，即可。

所述的一種維持小鼠上胚層干細胞自我更新狀態(tài)的培養(yǎng)方法，其特征在于：小鼠上胚層干細胞的獲取方法，包括以下步驟：

1)具有繁殖能力的129品系小鼠雌、雄各一只合籠，每天早上7-9點鐘檢查雌鼠陰道部位陰道栓的形成情況，第一次看到時，記為交配完成第0.5天；

2)確認交配完成后的第5.5天，以解剖方式獲得母鼠子宮內的胚胎，用玻璃針從胚外組織中分離得到上胚層組織；

3)取0.9-1.1ml、0.1％濃度的明膠加入Thermo NUNC 4孔細胞培養(yǎng)板中，置于36-38℃、4.9-5.1％CO₂濃度的細胞培養(yǎng)箱內，包被0.8-1.2h；

4)棄明膠，向培養(yǎng)孔內加入0.48-0.52ml DMEM培養(yǎng)基，其中含有：9-11％FBS，0.8-1.2％MEM非必須氨基酸，1.9-2.1mM L-Glutamin，0.09-0.11mMβ-巰基乙醇，0.8-1.2mM丙酮酸鈉，90-110單位的青霉素和90-110μg的鏈霉素；同時添加終濃度為3.8-4.2μM的IWR1和終濃度為0.8-1.2μM的Y27632兩種小分子化合物；

5)將2)步中分離得到的小鼠上胚層組織置于4)步的條件下，36-38℃、4-6％CO₂濃度培養(yǎng)一周后，胚胎組織向外生長，即可得到小鼠上胚層干細胞克隆集落。

所述的一種維持小鼠上胚層干細胞自我更新狀態(tài)的培養(yǎng)方法，其特征在于：小鼠上胚層干細胞自我更新與細胞特性檢測方法包括以下步驟：

1)形態(tài)觀察：使用Leica DMIL倒置相差顯微鏡對IWR1+Y27632條件下、不同培養(yǎng)天數的小鼠上胚層干細胞進行觀察，發(fā)現(xiàn)細胞逐漸形成扁平的克隆形態(tài)，細胞之間堆積緊密，集落邊界清晰，符合自我更新的形態(tài)特征；

將細胞多次傳代后，觀察不同代數細胞的培養(yǎng)形態(tài)，均保持自我更新的特征；

2)實時熒光定量PCR檢測自我更新標志基因Nanog、Oct4以及上胚層干細胞特性基因Fgf5的表達，具體方法如下：

取生長至70-80％密度的實驗組與對照組細胞，采用Trizol法抽提細胞總RNA；實驗組為IWR1+Y27632條件下培養(yǎng)的小鼠上胚層干細胞，對照組為保持在自我更新狀態(tài)下的小鼠上胚層干細胞；

利用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(TransGen)試劑盒，完成第一鏈cDNA的合成；以合成好的cDNA為模板，參照TransStart Tip Green qPCR SuperMix(TransGen)試劑盒，在Thermo PikoReal 96實時熒光定量PCR儀上進行基因表達水平的檢測；GAPDH基因為內參；

qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，實驗組中Nanog、Oct4以及Fgf5三種基因均保持正常的表達水平，說明在轉錄水平上，實驗組細胞處于未分化的狀態(tài)；

3)免疫熒光染色檢測自我更新標志蛋白Nanog和Oct4的表達，具體方法如下：

將小鼠上胚層干細胞在IWR1+Y27632條件下傳代培養(yǎng)2天左右后，棄培養(yǎng)液，用PBS漂洗細胞1次，加入3.8-4.2％濃度的多聚甲醛，室溫固定18-22min；

棄多聚甲醛，用PBS漂洗細胞1次，而后加入含4.5-5.5％濃度牛血清白蛋白、0.15-0.25％濃度Triton X-100的PBS封閉液，將細胞置于36-38℃溫箱，孵育0.8-1.2h；

棄封閉液，用PBS漂洗細胞1次，而后分別向不同孔細胞內加入含有Nanog一抗的稀釋液、含有Oct4一抗的稀釋液，用于分別檢測細胞內Nanog蛋白、Oct4蛋白的表達情況，3.5-4.5℃過夜；

次日，回收一抗，放置于3.5-4.5℃冰箱保存；用PBS漂洗細胞2-4次，每次1.5-2.5min，而后加入攜帶有熒光基團的二抗稀釋液，注意，需同時向二抗稀釋液內添加Hoechst染料，用于對細胞核進行染色，36-38℃避光孵育0.8-1.2h；

棄二抗稀釋液，用PBS漂洗細胞2-4次，而后在Leica DMI3000B型倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照；

免疫熒光結果顯示，Nanog和Oct4這兩種蛋白均保持正常的表達水平，說明在蛋白水平上，細胞處于自我更新的狀態(tài)。

所述的一種維持小鼠上胚層干細胞自我更新狀態(tài)的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述的含有Nanog一抗的稀釋液中，Nanog的參數為1:200,Sigma；所述的含有Oct4一抗的稀釋液中，Oct4參數為1:200,Sigma；上述的稀釋液均指的是含4.5-5.5％濃度牛血清白蛋白，0.15-0.25％濃度Triton X-100，0.8-1.2％濃度疊氮化鈉的PBS。

所述的一種維持小鼠上胚層干細胞自我更新狀態(tài)的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述的攜帶有熒光基團的二抗的稀釋液中，攜帶有熒光基團的二抗的參數為：1:500，碧云天；Hoechst染料的參數為：1：5000,Invitrogen；上述的稀釋液均指的是含4.5-5.5％濃度牛血清白蛋白，0.15-0.25％濃度Triton X-100的PBS。

本發(fā)明的具體操作，包括以下步驟：

(1)小鼠上胚層干細胞的獲取

1)具有繁殖能力的129品系小鼠雌、雄各一只合籠，每天早上9點鐘前檢查雌鼠陰道部位陰道栓的形成情況，第一次看到時，記為交配完成第0.5天；

2)確認交配完成后的第5.5天，以解剖方式獲得母鼠子宮內的胚胎，用玻璃針從胚外組織中分離得到上胚層組織；

3)取1ml 0.1％濃度的明膠加入Thermo NUNC 4孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5％CO₂濃度的細胞培養(yǎng)箱內，包被1h；

4)棄明膠，向培養(yǎng)孔內加入0.5ml DMEM培養(yǎng)基，其中含有：10％FBS，1％MEM非必須氨基酸，2mM L-Glutamin，0.1mMβ-巰基乙醇，1mM丙酮酸鈉，100單位的青霉素和100μg的鏈霉素；同時添加終濃度為4μM的IWR1和終濃度為1μM的Y27632兩種小分子化合物。

5)將2)步中分離得到的小鼠上胚層組織置于4)步的條件下，37℃、5％CO₂濃度培養(yǎng)一周后，胚胎組織向外生長，即可得到小鼠上胚層干細胞克隆集落。(2)小鼠上胚層干細胞在IWR1+Y27632條件下的傳代和培養(yǎng)

1)取1.5ml 0.1％濃度的明膠加入35mm BD Falcon細胞培養(yǎng)皿，置于37℃、5％CO₂濃度的細胞培養(yǎng)箱內，包被1h；

2)取生長至70％-80％密度的上胚層干細胞，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞1次，以除去殘留的培養(yǎng)液；

3)加入1ml 0.1％濃度的膠原酶Ⅳ消化細胞，5min左右，細胞邊緣浮起，用移液器吹打，轉移至15ml Eppendorf離心管中，加入3ml DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)吹打，使之混勻而終止消化；

4)1000rpm，離心3min后，吸去上清，加入3ml培養(yǎng)液重懸細胞；

5)重復步驟4)；

6)1000rpm，離心3min，吸去上清后，加入適量培養(yǎng)液重懸細胞，在顯微鏡下利用血球計數板對懸液中的細胞進行計數(對于壓線細胞，采取計上不計下，計左不計右的原則進行計數)，并以此計算出細胞的密度，細胞密度計算公式為ρ(個/ml)＝(四角大方格細胞總數/4)×10⁴；

7)取已包被好的培養(yǎng)皿，棄明膠，向培養(yǎng)皿孔內加入2ml DMEM培養(yǎng)基，其中含有：10％FBS，1％MEM非必須氨基酸，2mM L-Glutamin，0.1mMβ-巰基乙醇，1mM丙酮酸鈉，100單位的青霉素和100μg的鏈霉素；

8)向培養(yǎng)基中加入2×10⁴個細胞，水平十字形晃動，使細胞分布均勻；

9)依次添加4μM IWR1和1μM Y27632，水平十字形晃動，使其混合均勻；

10)將細胞培養(yǎng)皿置于37℃、5％CO₂濃度的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

(3)自我更新與細胞特性檢測

1)形態(tài)觀察：使用Leica DMIL倒置相差顯微鏡對IWR1+Y27632條件下、不同培養(yǎng)天數的小鼠上胚層干細胞進行觀察，發(fā)現(xiàn)細胞逐漸形成扁平的克隆形態(tài)，細胞之間堆積緊密，集落邊界清晰，符合自我更新的形態(tài)特征；

將細胞多次傳代后，觀察不同代數細胞的培養(yǎng)形態(tài)，均保持自我更新的特征；

2)實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測自我更新標志基因Nanog、Oct4以及上胚層干細胞特性基因Fgf5的表達，具體方法如下：

取生長至70％-80％密度的實驗組與對照組細胞，實驗組為IWR1+Y27632條件下培養(yǎng)的小鼠上胚層干細胞；對照組分為正、負兩組，正組為保持在自我更新狀態(tài)下的小鼠上胚層干細胞，負組為分化后的小鼠上胚層干細胞；

采用Trizol法抽提細胞總RNA，方法為：棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞2次，加入500μl Trizol裂解細胞，用移液器反復吹打2min后，轉移至1.5ml離心管中；向離心管中加入100μl三氯甲烷，用力搖晃15s，靜置2min后4℃離心10min，12000rpm；將上清吸取到另一個干凈的離心管中，注意不要吸到中間層；按1:1的比例向上清中加入異丙醇，輕搖使之混勻，靜置10min后4℃離心10min；離心后可在管底看到少量白色沉淀，棄上清，向離心管中加入1ml 75％濃度的乙醇，上下倒轉、搖晃、輕彈；4℃離心5min，棄上清，加入1ml 75％濃度的乙醇，4℃離心5min后，棄上清，將離心管倒立于干凈的吸水紙上，待管底的白色沉淀變透明后，加入40-50μl ddH₂O，置于4℃或-20℃保存；

獲得待測細胞的總RNA后，利用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(TransGen)試劑盒，完成第一鏈cDNA的合成；以合成好的cDNA為模板，參照TransStart Tip Green qPCR SuperMix(TransGen)試劑盒，在Thermo PikoReal 96實時熒光定量PCR儀上進行基因表達水平的檢測；

以GAPDH為內參基因，各引物序列如下：

qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，實驗組中Nanog、Oct4以及Fgf5三種基因均保持正常的表達水平，說明在轉錄水平上，實驗組細胞處于未分化的狀態(tài)；

3)免疫熒光染色檢測自我更新標志蛋白Nanog和Oct4的表達，具體方法如下：

設置實驗組與對照組細胞，實驗組為IWR1+Y27632條件下培養(yǎng)的小鼠上胚層干細胞；對照組分為正、負兩組，正組為保持在自我更新狀態(tài)下的小鼠上胚層干細胞，負組為分化后的小鼠上胚層干細胞；

將各組細胞傳代培養(yǎng)2天后，棄培養(yǎng)液，用PBS漂洗1次，加入4％濃度的多聚甲醛，室溫固定20min；

棄多聚甲醛，用PBS漂洗細胞1次，而后加入封閉液(含5％濃度牛血清白蛋白，0.2％濃度Triton X-100的PBS)，將細胞置于37℃溫箱，孵育1h；

棄封閉液，用PBS漂洗細胞1次，而后分別向不同孔細胞內加入含有Nanog(1:200,Sigma)一抗、含有Oct4(1:200,Sigma)一抗的稀釋液(稀釋液為含5％濃度牛血清白蛋白，0.2％濃度Triton X-100，1％濃度疊氮化鈉的PBS)，4℃過夜；

次日，回收一抗，放置于4℃冰箱保存；用PBS漂洗細胞3次，每次2min，而后分別加入攜帶有熒光基團的二抗(1:500，碧云天)的稀釋液(含5％濃度牛血清白蛋白，0.2％濃度Triton X-100的PBS)，稀釋液中需同時加入Hoechst(1:5000,Invitrogen)染料，37℃避光孵育1h；

棄二抗稀釋液，用PBS漂洗細胞3次，而后在Leica DMI3000B型倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照；

Nanog蛋白一抗為兔來源，Oct4蛋白一抗為鼠來源，二抗分別為帶488熒光基團的羊抗兔、羊抗鼠抗體，在熒光顯微鏡下觀察時呈現(xiàn)綠色熒光；Hoechst染料用于對細胞核進行染色，熒光顯微鏡下呈現(xiàn)藍色熒光；

免疫熒光結果顯示，Nanog和Oct4均保持正常的表達水平，說明在蛋白水平上，細胞處于自我更新的狀態(tài)。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明采用在10％FBS含量的DMEM培養(yǎng)基中加入IWR1和Y27632兩種小分子的方法來培養(yǎng)小鼠上胚層干細胞，在此種培養(yǎng)條件下，細胞生長情況良好，能夠維持自我更新的狀態(tài)，可多次傳代，不出現(xiàn)分化現(xiàn)象。

(2)與傳統(tǒng)CDM/AF的培養(yǎng)條件相比，本發(fā)明具有更加穩(wěn)定的培養(yǎng)效果，可以使細胞維持在最佳的生長狀態(tài)，易于使用單細胞裂解的方式進行傳代，簡化操作步驟和流程，省時省力，利于基礎研究的開展。

(3)與現(xiàn)有的Activin A+bFGF+飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)條件相比，本發(fā)明具有更加經濟高效的優(yōu)點，可顯著節(jié)省培養(yǎng)成本；同時，簡化細胞因子的添加種類以及避免飼養(yǎng)層細胞的使用，利于后續(xù)對細胞內相關信號通路與分子調控機制展開深入探究。

(4)本發(fā)明所摸索出的培養(yǎng)條件，可以為改善目前人胚胎干細胞以及其他種類多能性干細胞的培養(yǎng)條件提供線索。

附圖說明

圖1為三種條件下培養(yǎng)的P7代小鼠上胚層干細胞在相差顯微鏡下的形態(tài)圖，其中，左側為Activin A+bFGF+IWR1+Y27632條件下培養(yǎng)的細胞，處于自我更新的狀態(tài)；中間為IWR1+Y27632條件下培養(yǎng)的細胞，符合自我更新狀態(tài)的特征；右側為不添加Activin A+bFGF+IWR1+Y27632培養(yǎng)的細胞，處于分化狀態(tài)。

圖2為三種條件下培養(yǎng)的P9代小鼠上胚層干細胞中自我更新標志基因以及特性基因的qRT-PCR檢測結果，其中，“AbIY”代表Activin A+bFGF+IWR1+Y27632的培養(yǎng)條件，“IY”代表IWR1+Y27632的培養(yǎng)條件，“NT(No Treatment)”代表不加入Activin A+bFGF+IWR1+Y27632的培養(yǎng)條件。取Activin A+bFGF+IWR1+Y27632條件下培養(yǎng)的細胞內相應基因的表達量為參照值“1”，用GraphPad Prism 5軟件繪制各基因相對表達量的直方圖。

圖3是對三種條件下培養(yǎng)的P10代小鼠上胚層干細胞進行自我更新標志蛋白的檢測，所用的檢測方法為免疫熒光染色。在熒光顯微鏡下觀察時，Nanog與Oct4蛋白呈現(xiàn)綠色熒光；Hoechst染料用來顯示細胞核的位置，熒光顯微鏡下呈現(xiàn)藍色熒光。

圖4為IWR1+Y27632條件下P13代的小鼠上胚層干細胞；視野里呈現(xiàn)出扁平的克隆形態(tài)，細胞之間堆積緊密，集落邊界清晰，符合自我更新的形態(tài)特征。

圖5為以對照組細胞中相應基因的表達量為參照值“1”，根據Ct值等參數信息、利用GraphPad Prism 5繪圖軟件繪制各基因相對表達量的直方圖。

圖6為免疫熒光染色圖。

具體實施方式

實施例

(1)小鼠上胚層干細胞的獲取

1)具有繁殖能力的129品系小鼠雌、雄各一只合籠，每天早上9點鐘前檢查雌鼠陰道部位陰道栓的形成情況，第一次看到時，記為交配完成第0.5天；

2)確認交配完成后的第5.5天，以解剖方式獲得母鼠子宮內的胚胎，用玻璃針從胚外組織中分離得到上胚層組織；

3)取1ml 0.1％濃度的明膠加入Thermo NUNC 4孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5％CO₂濃度的細胞培養(yǎng)箱內，包被1h；

4)棄明膠，向培養(yǎng)孔內加入0.5ml DMEM培養(yǎng)基，其中含有：10％FBS，1％MEM非必須氨基酸，2mM L-Glutamin，0.1mMβ-巰基乙醇，1mM丙酮酸鈉，100單位的青霉素和100μg的鏈霉素；同時添加終濃度為4μM的IWR1和終濃度為1μM的Y27632兩種小分子化合物。

5)將2)步中分離得到的小鼠上胚層組織置于4)步的條件下，37℃、5％CO₂濃度培養(yǎng)一周后，胚胎組織向外生長，即可得到小鼠上胚層干細胞克隆集落。(2)小鼠上胚層干細胞在IWR1+Y27632條件下的傳代和培養(yǎng)

1)取1.5ml 0.1％濃度的明膠加入35mm BD Falcon細胞培養(yǎng)皿，置于37℃、5％CO₂濃度的細胞培養(yǎng)箱內，包被1h；

2)取覆蓋密度達到80％的小鼠上胚層干細胞，棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，以除去殘留的培養(yǎng)液；

3)加入1ml 0.1％濃度的膠原酶Ⅳ消化細胞，5min左右，觀察到細胞邊緣浮起后，用移液器吹打，轉移至15ml Eppendorf離心管中，加入3ml DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)吹打，使之混勻而終止消化；

4)1000rpm，離心3min后，吸去上清，加入3ml培養(yǎng)液重懸細胞；

5)重復步驟4)；

6)1000rpm，離心3min，吸去上清后，加入1ml培養(yǎng)液重懸細胞，在顯微鏡下利用血球計數板對懸液中的細胞進行計數(對于壓線細胞，采取計上不計下，計左不計右的原則進行計數)，根據密度公式ρ(個/ml)＝(四角大方格細胞總數/4)×10⁴計算出1ml懸液中含有2×10⁶個細胞；

7)取已包被好的培養(yǎng)皿，棄明膠，向培養(yǎng)皿孔內加入2ml DMEM培養(yǎng)基，其中含有：10％FBS，1％MEM非必須氨基酸，2mM L-Glutamin，0.1mMβ-巰基乙醇，1mM丙酮酸鈉，100單位的青霉素和100μg的鏈霉素；

8)向培養(yǎng)基中加入10μl懸液(2×10⁴個細胞)，水平十字形晃動，使細胞分布均勻；

9)依次添加4μM IWR1和1μM Y27632，水平十字形晃動，使其混合均勻；

10)將細胞培養(yǎng)皿置于37℃、5％CO₂濃度的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

(3)自我更新與細胞特性檢測

1)形態(tài)觀察：使用Leica DMIL倒置相差顯微鏡觀察IWR1+Y27632條件下P13代的小鼠上胚層干細胞，視野里呈現(xiàn)出扁平的克隆形態(tài)，細胞之間堆積緊密，集落邊界清晰，符合自我更新的形態(tài)特征，如圖4所示；

2)實時熒光定量PCR(qRT-PCR)：

設置實驗組與對照組細胞，實驗組為IWR1+Y27632條件下培養(yǎng)的P8代小鼠上胚層干細胞，對照組為保持在自我更新狀態(tài)下的P8代小鼠上胚層干細胞；

利用Primer3Plus網站設計Nanog、Oct4、Fgf5以及GAPDH四種基因的引物序列，其中，Nanog、Oct4為自我更新標志基因，F(xiàn)gf5為小鼠上胚層干細胞特性基因，GAPDH作為內參基因；引物設計完成后交由上海生工公司進行合成；

待實驗組與對照組細胞生長到80％覆蓋密度后，采用Trizol法分別抽提每組細胞的總RNA；

以每組細胞的總RNA為模板，利用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(TransGen)試劑盒，將總RNA逆轉錄成cDNA；

分別將cDNA與各引物稀釋到所需濃度，參照TransStart Tip Green qPCR SuperMix(TransGen)試劑盒說明書提供的反應體系與擴增程序，在Thermo PikoReal 96實時熒光定量PCR儀上進行相關操作；

反應完成后，利用與熒光定量PCR儀配套的Piko Real Software 2.2軟件，查看并導出熔解曲線、Ct值等關鍵參數；

以對照組細胞中相應基因的表達量為參照值“1”，根據Ct值等參數信息、利用GraphPad Prism 5繪圖軟件繪制各基因相對表達量的直方圖，如圖5；

qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，實驗組中Nanog、Oct4以及Fgf5三種基因均保持正常的表達水平，說明在轉錄水平上，IWR1+Y27632條件下的P8代小鼠上胚層干細胞處于未分化狀態(tài)。

3)免疫熒光染色：

取IWR1+Y27632條件下培養(yǎng)的P10代小鼠上胚層干細胞；棄培液，4％多聚甲醛室溫固定20min；PBS漂洗后加入封閉液(含5％濃度牛血清白蛋白，0.2％濃度Triton X-100的PBS)，37℃溫箱孵育1h；棄封閉液，用PBS漂洗細胞1次，分別向不同孔細胞內加入含有Nanog(1:200,Sigma)一抗、含有Oct4(1:200,Sigma)一抗的稀釋液，4℃過夜；次日PBS漂洗3次；根據每孔細胞所加入的一抗，相應添加攜帶488熒光基團的羊抗兔或羊抗鼠抗體的二抗(1:500，碧云天)稀釋液，稀釋液中需同時加入Hoechst(1：5000,Invitrogen)染料，37℃避光孵育1h；PBS漂洗后在熒光顯微鏡下觀察拍照，結果如圖6所示，Nanog、Oct4均保持正常表達水平，說明細胞處于自我更新狀態(tài)。

基因名稱 基因序列

GAPDH F: TGTGAGGGAGATGCTCAGTG

R: TGTTCCTACCCCCAATGTGT

Nanog F: AAGCAGAAGATGCGGACTGT

R: ATCTGCTGGAGGCTGAGGTA

Oct4 F: CCAATCAGCTTGGGCTAGAG

R: CTGGGAAAGGTGTCCCTGTA

Fgf5 F: GCGACGTTTTCTTCGTCTTC

R: GATGCCCACTCTGCAGTACA