本發(fā)明屬于水牛胚胎培養(yǎng)及檢測
技術領域：
，尤其涉及一種適合代謝組學水牛胚胎培養(yǎng)及檢測胚胎發(fā)育潛能的方法。
背景技術：
：代謝組學是研究細胞和生物體的所有代謝中間體和終產(chǎn)物的一門新興科學，相對于DNA或蛋白質等生物高分子而言，代謝組學的研究對象一股為分子質量在1000Da以下的小分子。由于代謝網(wǎng)絡處于基因調控、信號傳導及蛋白質互作網(wǎng)絡的下游，因此代謝組學研究反映了基因組、轉錄組和蛋白質組受內外環(huán)境影響下相互協(xié)調作用的最終結果，代謝組學的研究更接近于細胞或生物的表型。代謝組的功能和代謝組學的重要性使代謝組學成為生物學中繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學后的又一個重要的組學平臺，被廣泛地應用于醫(yī)學、藥學、微生物學、環(huán)境學和食品科學等生命科學的各個研究領域。代謝組學具有如下特點：首先，與細胞或機體的基因和蛋白質相比，代謝物數(shù)量顯著少，人類基因組大約包含2.5萬個基因，編碼10萬～20萬個轉錄子，翻譯100萬種蛋白質，卻僅產(chǎn)生2500～3000種代謝物，故代謝組檢測要比轉錄組或蛋白組檢測簡單廉價。其次，轉錄組及蛋白組的改變并不總是與細胞表型相關，而代謝物組是基因表達的終產(chǎn)物，反應了細胞的真實功能狀態(tài)，可較前者更準確地評估基因功能。最后，基因過度表達等微小變化經(jīng)轉錄組和蛋白組逐級放大后，在代謝物水平上更易被檢測。胚胎質量的優(yōu)劣直接關系到胚胎移植后妊娠效率。目前對胚胎質量的評估中，應用最為廣泛的是對胚胎發(fā)育時期各階段的形態(tài)特征進行評分。近年來在形態(tài)學結合實時成像分析系統(tǒng)對胚胎發(fā)育過程進行連續(xù)觀察并對其進行選擇，但卻無具體的數(shù)值標準來判定，且容易受觀察者主觀影響。而通過檢測胚胎培養(yǎng)基中代謝物的代謝組學方法可更有效地分析胚胎活性，有效地反映細胞發(fā)育情況，預測胚胎發(fā)育的最終結果，對提高胚胎附植率將有重要的意義。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種適合代謝組學水牛胚胎培養(yǎng)及檢測胚胎發(fā)育潛能的方法，該法可為胚胎生產(chǎn)中的胚胎移植前胚胎質量提供判斷依據(jù)。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案：適合代謝組學的水牛胚胎培養(yǎng)方法，第一步，取未成熟的水牛卵母細胞，經(jīng)體外成熟、體外受精后獲得假定受精胚胎進行群體培養(yǎng)；第二步，待胚胎發(fā)育到囊胚階段，進行單胚胎培養(yǎng)。上述適合代謝組學的水牛胚胎培養(yǎng)方法，按以下操作進行：取未成熟的水牛卵母細胞進行體外成熟，將體外成熟的卵子經(jīng)體外受精后，把假定受精胚胎放到共培養(yǎng)液體系中，微滴群體培養(yǎng)；待胚胎發(fā)育到囊胚階段，用撿卵針撿出囊胚，用PBS溶液洗滌1-2次，放入事先在培養(yǎng)箱中平衡2h以上的20μl蓋油的SOF液(SOF液成分參照Carolantetal.，1995，Theriogenology43：1115-l128)培養(yǎng)，每個胚胎一滴，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5-6h后，收集代謝液到200μl的EP管中-80℃凍存。檢測水牛胚胎發(fā)育潛能的方法，按上述培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，單胚胎培養(yǎng)后收集代謝液；通過LC/MS檢測囊胚代謝液成分，通過PCA數(shù)據(jù)分析鑒定胚胎發(fā)育能力。代謝液按以下操作進行預處理：首先把樣品從-80℃冰箱中，放入冰面上解凍，然后用超純水預洗滌一次膜的MerckMillipore離心過濾管，4度12000g.min-1離心15min。LC/MS檢測條件及參數(shù)按以下設置：選擇前用乙晴沖洗柱子15min，用95％的0.1％甲酸水平衡柱子15min；選擇方法：液相，A相0.1％甲酸水，B相100％乙腈；其中，0-2min5％乙腈，2-20min5％乙腈-95％乙腈，20min-23min100％乙晴，23min-23.1min5％乙晴，23.1min-25min5％乙晴，流速為0.30mL/min；進樣量：2μL；一級質譜參數(shù)：二級質譜參數(shù)：HESTSOURCE參數(shù)：針對目前水牛胚胎質量檢測存在的問題，發(fā)明人建立了一種適合代謝組學的水牛胚胎二步培養(yǎng)法，該法經(jīng)體外成熟、體外受精后獲得假定受精胚胎進行群體培養(yǎng)，待胚胎發(fā)育到囊胚階段，進行單胚胎培養(yǎng)。以此為基礎，發(fā)明人還建立了一種檢測水牛胚胎發(fā)育潛能的方法，即按上述培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，單胚胎培養(yǎng)后收集代謝液；通過LC/MS檢測囊胚代謝液成分，通過PCA數(shù)據(jù)分析鑒定胚胎發(fā)育能力。試驗表明，本發(fā)明根據(jù)PCA數(shù)據(jù)的特點，以孵化能力作為判定，可以對胚胎發(fā)育潛能進行預測，直接應用與胚胎體外生產(chǎn)中胚胎移植前，對胚胎質量進行有數(shù)據(jù)依據(jù)的檢測，避免了肉眼預測選擇胚胎的缺陷，彌補了人為判斷的不足，將大大節(jié)約生產(chǎn)中的經(jīng)濟成本。附圖說明圖1是應用本發(fā)明檢測水牛胚胎發(fā)育潛能的負極質譜圖。圖中：對照組為1藍色點，胚胎代謝液檢測組為2紅色點。具體實施方式實施例1兩步法收集水牛囊胚代謝液第一步，經(jīng)屠宰場獲得的卵巢，抽取未成熟的水牛卵母細胞進行體外成熟，將體外成熟的卵子經(jīng)體外受精后，把假定受精胚胎放到共培養(yǎng)液體系中，微滴群體培養(yǎng)，20μl的培養(yǎng)體系中放入15-20個胚胎，蓋油；第二步，將體外受精第7d發(fā)育到桑葚胚胎階段的胚胎，用撿卵針撿出發(fā)育到桑葚胚或囊胚的胚胎，用PBS溶液洗滌1-2次(以消除原有代謝液成分的影響)，放入事先在培養(yǎng)箱中平衡2h以上的20μl蓋油的SOF液(無血清)培養(yǎng)，每個胚胎一滴，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5-6h后，從培養(yǎng)箱拿出，用1ml移液器吸出所蓋礦物油，待在40倍的體式顯微鏡下觀察到液滴的頂端無油覆蓋時終止吸礦物油。用內徑為0.5-0.8mm的撿卵針把代謝液放入到500μl的滅菌EP管中，再把胚胎移入到含有血清的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，檢測胚胎的孵化潛能。每個胚胎對應一管代謝液，每個胚胎為17μl左右代謝液放入-80℃的冰箱中待檢測，在代謝液進行處理分析前，保持代謝液的凍存狀態(tài)。結果顯示，采用兩步法，在囊胚期進行單滴培養(yǎng)，從囊胚率上兩步法培養(yǎng)的囊胚孵化率為4.85％，對照---群體培養(yǎng)組(從受精后，假定胚胎直到發(fā)育到囊胚一直采用群體培養(yǎng))的對照組為3.85％，差異不顯著。說明在胚胎發(fā)育到囊胚階段進行單滴培養(yǎng)收集代謝液，沒有影響到囊胚的孵化情況，見表1。表1兩步水牛單胚胎培養(yǎng)方法不同組別比較組別總胚胎數(shù)孵化數(shù)(％)兩步法培養(yǎng)37118(4.85)對照組1044(3.85)實施例2應用LC/MS進行水牛單囊胚代謝液的檢測(1)采用兩步法收集囊胚階段的代謝液參照實施例1。(2)LC/MS檢測代謝液的成分樣品的預處理：由于培養(yǎng)液中帶有0.3％的BSA，因此，在LC/MS檢測前，要進行去除蛋白質大分子物質，首先把樣品從-80℃冰箱中，放入冰面上解凍，然后用超純水預洗滌一次膜的MerckMillipore離心過濾管，4度12000g.min-1離心15min，去除代謝液中BSA(牛血清白蛋白)的影響。LC/MS檢測參數(shù)選擇前用乙晴沖洗柱子15min，用95％的0.1％甲酸水平衡柱子15min。選擇方法：液相，A相0.1％甲酸水，B相100％乙腈；其中，0-2min5％乙腈，2-20min5％乙腈-95％乙腈，20min-23min100％乙晴，23min-23.1min5％乙晴，23.1min-25min5％乙晴，流速為0.30mL/min；進樣量：2μL；一級質譜參數(shù)：二級質譜(dd-MS2/dd-SIM)參數(shù)：HESTSOURCE參數(shù)：(3)PCA分析得到的負極質譜圖，導入到熱電公司的Sevier軟件中，進行主成分分析(PCA分析)。從圖1中可以看到，通過上述實施方式，對照組的代謝液(不放囊胚，但同樣的處理條件)與囊胚代謝液組(放囊胚的代謝液，處理條件與對照組相同)，經(jīng)過LC/MS處理，在負極模式下，經(jīng)過PCA分析，完全可以將對照組與囊胚代謝液組分開。當前第1頁1 2 3