本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
產(chǎn)前診斷是優(yōu)生學(xué)的重要組成部分，它是建立在遺傳咨詢基礎(chǔ)上通過產(chǎn)前檢測胎兒健康情況，對患有嚴(yán)重遺傳病、先天畸形的患兒可以及早采取措施，減少人群中有害基因積累，以減少患兒出生，提高人口素質(zhì)，因此，具有十分重要的意義。產(chǎn)前診斷目前主要有孕早期絨毛組織取材、孕中期羊水和臍帶血、孕婦外周血分離胎兒細(xì)胞及植入前診斷等方法，但孕中期羊水細(xì)胞檢查仍是最主要的診斷方法。
羊水穿刺檢查的合適對象為高齡(大于34歲)、不良接觸史、既往畸胎弱智分娩史、既往染色體異常兒分娩史、夫妻之一核型異常、B超示畸型、家族性連鎖遺傳病史、近親婚配等的孕婦。其中，高齡孕婦是主要檢查對象。羊水細(xì)胞培養(yǎng)后通過染色體顯帶技術(shù)，能夠辨別三體綜合癥、平衡易位、倒位以及性染色體異常等染色體方面的疾病。成功的羊水細(xì)胞培養(yǎng)，除需要嚴(yán)格的實驗操作技術(shù)和經(jīng)驗外，培養(yǎng)基的組成也是非常關(guān)鍵的。羊水細(xì)胞可能是胎兒皮膚、消化道、呼吸道及泌尿生殖道脫落的細(xì)胞，其中只有小部分是有活力的細(xì)胞(約0.1％),而活力細(xì)胞又以貼壁型細(xì)胞為主。如何能促其在體外培養(yǎng)中貼壁增殖，是成功培養(yǎng)羊水細(xì)胞的關(guān)鍵因素。
中國專利申請CN102618493A公開了一種羊水與絨毛細(xì)胞培養(yǎng)基，包含下列組分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基，胎牛血清，生長因子，抗氧化劑、抗生素和緩沖系統(tǒng)。中國專利申請CN105039244A公開了一種低血清羊水細(xì)胞培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI1640/αMEM按1：1混合的基礎(chǔ)上，添加包括以下組分：胰島素、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、表皮細(xì)胞生長因子、牛血清白蛋白、氫化可的松、α生育酚、NaHCO3、檸檬酸鐵、吐溫80、乙醇胺、油酸、亞油酸以及胎牛血清，其中，胎牛血清添加含量占低血清培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基總體積不超過1％。
目前，對于羊水細(xì)胞的體外培養(yǎng)有的含有血清，含有血清的培養(yǎng)基無法規(guī)避動物血清中的異源體，如果使用動物血清培養(yǎng)基培育出來的細(xì)胞，會存在人體異源體排斥和沖突。有的培養(yǎng)基雖然不含有血清，但是存在培養(yǎng)成功率低，培養(yǎng)周期長等問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基不含血清，避免了使用血清導(dǎo)致的異種成分引起的排斥現(xiàn)象，能更迅速有效地增加體外增殖的羊水細(xì)胞克隆數(shù)目和細(xì)胞增殖速度，大大縮短了羊水細(xì)胞培養(yǎng)周期，獲得更多的分裂相染色體數(shù)目。
本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：酵母抽提物14-38μg/mL，香菇多糖8-16μg/mL，人血白蛋白1-3mg/mL，胰島素0.4-0.8μg/mL，表皮生長因子24-35ng/mL，聚乳酸-乙醇酸共聚物5-12mg/mL，維生素B 30-40μg/mL，硬脂酸8-12μM，L-谷氨酰胺1-2μM，棕櫚酸5-8μM。
一種培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，優(yōu)選的方案是，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：酵母抽提物25μg/mL，香菇多糖12μg/mL，人血白蛋白2mg/mL，胰島素0.6μg/mL，表皮生長因子30ng/mL，聚乳酸-乙醇酸共聚物7mg/mL，維生素B 36μg/mL，硬脂酸10μM，L-谷氨酰胺1.5μM，棕櫚酸6μM。
優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM或F12培養(yǎng)基。
另外，本發(fā)明還提供了所述培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的制備方法，步驟如下：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入聚乳酸-乙醇酸共聚物，攪拌均勻，靜置20-40分鐘，加入酵母抽提物、香菇多糖、人血白蛋白、胰島素、表皮生長因子、維生素B、硬脂酸、L-谷氨酰胺和棕櫚酸，混合均勻，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-10％的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.0-7.5，即得。
優(yōu)選地，所述步驟S1靜置30分鐘。
優(yōu)選地，所述步驟S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7％的氫氧化鈉溶液。
優(yōu)選地，所述步驟S2調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.2。
本發(fā)明提供的培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，加入的添加劑包括：酵母抽提物、香菇多糖、聚乳酸-乙醇酸共聚物、維生素B等。本發(fā)明提供的培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基搭配合理，各成分間相互協(xié)調(diào)，共同作用，能夠更迅速有效地增加體外增殖的羊水細(xì)胞克隆數(shù)目和細(xì)胞增殖速度，大大縮短了羊水細(xì)胞培養(yǎng)周期，獲得更多的分裂相染色體數(shù)目。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基具有以下優(yōu)勢：
(1)本發(fā)明提供的培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基不含血清，避免了使用血清導(dǎo)致的異種成分引起的排斥現(xiàn)象。
(2)本發(fā)明提供的培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，能更迅速有效地增加體外增殖的羊水細(xì)胞克隆數(shù)目和細(xì)胞增殖速度，大大縮短了羊水細(xì)胞培養(yǎng)周期。
(3)本發(fā)明提供的培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基能夠在較短的時間內(nèi)，獲得更多的分裂相染色體數(shù)，能夠滿足臨床檢測的要求。
(4)本發(fā)明提供的是一種無動物源性成分、成分確定的培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，可以有效保證產(chǎn)品批次的質(zhì)量穩(wěn)定性，有利于產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化。
具體實施方式
以下通過具體實施方式的描述對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明所用酵母抽提物可購自武漢信之德生物科技有限公司，食品級，DMEM培養(yǎng)基可購自Gibco公司，F(xiàn)12培養(yǎng)基可購自Gibco公司，香菇多糖可購自河南青甲貿(mào)易有限公司，食品級，聚乳酸-乙醇酸共聚物可購自上海納頓化工科技有限公司，型號LH050。
實施例1、一種培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基
所述培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：酵母抽提物14μg/mL，香菇多糖8μg/mL，人血白蛋白1mg/mL，胰島素0.4μg/mL，表皮生長因子24ng/mL，聚乳酸-乙醇酸共聚物5mg/mL，維生素B 30μg/mL，硬脂酸8μM，L-谷氨酰胺1μM，棕櫚酸5μM。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基。
制備方法：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入聚乳酸-乙醇酸共聚物，攪拌均勻，靜置20分鐘，加入酵母抽提物、香菇多糖、人血白蛋白、胰島素、表皮生長因子、維生素B、硬脂酸、L-谷氨酰胺和棕櫚酸，混合均勻，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.0，即得。
實施例2、一種培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基
所述培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：酵母抽提物38μg/mL，香菇多糖16μg/mL，人血白蛋白3mg/mL，胰島素0.8μg/mL，表皮生長因子35ng/mL，聚乳酸-乙醇酸共聚物12mg/mL，維生素B 40μg/mL，硬脂酸12μM，L-谷氨酰胺2μM，棕櫚酸8μM。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。
制備方法：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入聚乳酸-乙醇酸共聚物，攪拌均勻，靜置40分鐘，加入酵母抽提物、香菇多糖、人血白蛋白、胰島素、表皮生長因子、維生素B、硬脂酸、L-谷氨酰胺和棕櫚酸，混合均勻，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.5，即得。
實施例3、一種培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基
所述培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：酵母抽提物25μg/mL，香菇多糖12μg/mL，人血白蛋白2mg/mL，胰島素0.6μg/mL，表皮生長因子30ng/mL，聚乳酸-乙醇酸共聚物7mg/mL，維生素B 36μg/mL，硬脂酸10μM，L-谷氨酰胺1.5μM，棕櫚酸6μM。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。
制備方法：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入聚乳酸-乙醇酸共聚物，攪拌均勻，靜置30分鐘，加入酵母抽提物、香菇多糖、人血白蛋白、胰島素、表皮生長因子、維生素B、硬脂酸、L-谷氨酰胺和棕櫚酸，混合均勻，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7％的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.2，即得。
對比例1、一種培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基
所述培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：酵母抽提物25μg/mL，銀耳多糖12μg/mL，人血白蛋白2mg/mL，胰島素0.6μg/mL，表皮生長因子30ng/mL，聚乳酸-乙醇酸共聚物7mg/mL，維生素B 36μg/mL，硬脂酸10μM，L-谷氨酰胺1.5μM，棕櫚酸6μM。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。
制備方法與實施例3類似。
與實施例3的區(qū)別在于，將香菇多糖替換為銀耳多糖。
對比例2、一種培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基
所述培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：酵母抽提物25μg/mL，香菇多糖12μg/mL，人血白蛋白2mg/mL，胰島素0.6μg/mL，表皮生長因子30ng/mL，聚乙烯醇7mg/mL，維生素B 36μg/mL，硬脂酸10μM，L-谷氨酰胺1.5μM，棕櫚酸6μM。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。
制備方法與實施例3類似。
與實施例3的區(qū)別在于，將聚乳酸-乙醇酸共聚物替換為聚乙烯醇。
試驗例一、本發(fā)明培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基對羊水細(xì)胞的培養(yǎng)效果
1、試驗對象：本發(fā)明實施例1-3所得培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，以及對比例1和對比例2所得培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。
2、試驗方法：
羊水細(xì)胞培養(yǎng)：收集羊水樣品(為17-22周齡之間的羊水樣品，每份0.5mL，共10mL)，混合均勻，得到檢測用羊水細(xì)胞收集樣品Ⅰ，比較不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果。細(xì)胞培養(yǎng)、制片方法按以下步驟進行：
(1)在無菌條件下取羊水各2.0mL/管，共5管；
(2)以1500r/min室溫離心10分鐘；
(3)在無菌操作臺上吸去上清液，每管留0.5mL，吸管打散細(xì)胞。制成細(xì)胞懸液，再加入4.5mL培養(yǎng)基入管內(nèi)，吸管輕混勻，移至25cm2方形一次性培養(yǎng)瓶中置含5％CO2的37℃溫箱飽和濕度行開放式培養(yǎng)；
(4)6天后鏡下觀察，可見成纖維樣或上皮細(xì)胞生長，當(dāng)細(xì)胞生長旺盛，在貼壁細(xì)胞層的背景上出現(xiàn)圓形細(xì)胞時，此時換相應(yīng)新鮮的羊水培養(yǎng)基5mL，48小時后，如細(xì)胞生長狀況好，加入秋水仙素0.05ug/mL(20ug/mL，7號針頭垂直豎加2滴)5h，進行細(xì)胞學(xué)處理；
(5)收獲細(xì)胞：倒出瓶中細(xì)胞液入10mL離心管，用0.85％NaCl溶液沖洗細(xì)胞壁兩遍，0.25％胰酶消化5分鐘，待細(xì)胞面出現(xiàn)肉眼可見皺形改變時即用吸管吹打下細(xì)胞，1500r/min室溫離心10分鐘，去上清，約留0.5mL；
(6)低滲：加入37℃0.075M KCl 5mL，吸管吹打，37℃水浴5分鐘；
(7)預(yù)固定：加入1.5mL甲醇：冰醋酸＝3：1固定劑，輕混勻，37℃水浴5分鐘，1500r/min室溫離心10分鐘；去上清留0.5mL；
(8)固定：加入3：1固定劑8mL，輕混勻，37℃水浴10分鐘，1500r/min室溫離心10分鐘；去上清，留0.5mL；
(9)重復(fù)固定：同上。1500r/min室溫離心10分鐘，去上清，視管底細(xì)胞量滴入固定劑；
(10)滴片、烤片：每片2滴，75℃烤箱烘烤3小時；
(11)培養(yǎng)結(jié)束，染色體制片前統(tǒng)計細(xì)胞克隆總數(shù)，包括有分裂相的克隆總數(shù)，以及有效克隆的大?。恢苽淙旧w后統(tǒng)計分裂相細(xì)胞數(shù)目；
(12)羊水細(xì)胞收集樣品Ⅰ培養(yǎng)7天后收獲，進行染色體制片。
3、實驗結(jié)果
本發(fā)明實施例1-3所得培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，以及對比例1和對比例2所得培養(yǎng)羊水細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基對羊水細(xì)胞的培養(yǎng)效果如表1所示。
表1：不同培養(yǎng)基對羊水細(xì)胞的培養(yǎng)效果比較
注：克隆大小判斷標(biāo)準(zhǔn)為：在100倍倒置顯微鏡下判斷觀察，克隆≥1個視野判斷為大克??；克隆≤1/2個視野則判斷為小克隆；介于兩者之間的為中等克隆?？偪寺?shù)＝有分裂相的總克隆數(shù)+無分裂相的克隆數(shù)。
從表1可以看出，在相同的培養(yǎng)時間內(nèi)，與對比例1和對比例2所得培養(yǎng)基相比，本發(fā)明實施例1-3所得培養(yǎng)基對羊水細(xì)胞的培養(yǎng)效果無論從總克隆數(shù)，還是分裂相細(xì)胞數(shù)目都有了大幅度提高。