本發(fā)明屬于蛋白肽的制備領域，具體涉及一種利用霉菌制備棉籽肽的方法。
背景技術(shù)：
棉籽粕是棉籽榨油浸提后的副產(chǎn)物，在我國餅粕類飼料原料中，其產(chǎn)量僅次于豆粕。其內(nèi)含粗蛋白35-50％，與豆粕相當，其蛋白質(zhì)功效比值、純消化率、生物學效價及蛋白質(zhì)凈利用率等指標均接近動物蛋白，必需氨基酸組成與聯(lián)合國糧農(nóng)組織(WHO)推薦的氨基酸組成較為接近，營養(yǎng)價值遠高于谷類蛋白，是重要的蛋白質(zhì)來源。
但是，棉籽蛋白結(jié)構(gòu)緊密、相對分子質(zhì)量大，不易被機體消化吸收，現(xiàn)代科學研究已經(jīng)表明，小分子肽比等量的氨基酸具有更高的生物活性和營養(yǎng)價值，肽類和氨基酸幾乎可以通過小腸絨毛上皮細胞完全吸收利用，進入到血液中，然后輸送到生物體的各個部位，肽類被生物體吸收的速度快于等量的游離氨基酸，更快于等量的蛋白質(zhì)。因此，蛋白質(zhì)尤其大分子蛋白質(zhì)須經(jīng)過消化，降解成小分子肽后才能被吸收利用，
同時，棉酚是棉籽粕中主要的抗營養(yǎng)成分，含量為0.11-0.18％，其中，具有活性醛基和活性羥基的游離棉酚毒性較大，含量超過安全界限，因此，用含有棉酚的棉籽粕作為蛋白質(zhì)來源，直接飼喂動物，易導致畜禽生長遲緩、繁殖率下降，中毒甚至死亡。并且，這種毒性游離棉酚可以和飼料中蛋白氨基酸殘基結(jié)合，生成不溶性復合物，與消化道中的蛋白水解酶結(jié)合，抑制其活性，由此降低蛋白質(zhì)的利用率。
因此，只有通過脫酚處理的棉籽產(chǎn)品才是相對安全的。根據(jù)國家標準GB-13078-91，原料棉籽餅粕中游離棉酚允許量≤1200mg/kg，世界衛(wèi)生組織建議的棉酚相對安全的含量為≤400mg/kg。
目前，棉籽粕中棉酚的降解方法常見的有物理法和化學法，但是，物理法工作量大，工藝條件苛刻，成本高，化學法存在易產(chǎn)生物質(zhì)殘留，對機體產(chǎn)生毒副作用，且蛋白質(zhì)降解率低，棉酚脫毒效率不明顯等問題。目前，微生物發(fā)酵處理法被認為是安全、脫毒效果好、生產(chǎn)成本低、最有發(fā)展前途的脫毒方法。
中國專利CN 104342471 A公開了“一種脫酚棉籽蛋白肽的制備方法”中通過枯草芽苞桿菌發(fā)酵的方法對棉籽粕進行脫毒處理，該方法處理后，原料棉籽粕中棉酚含量從0.15％降至0.03％-0.035％，脫毒效果不夠徹底，并且發(fā)酵時間長。
中國專利CN 104273328 A通過霉菌和芽孢桿菌菌種混合發(fā)酵的方法獲得一種棉籽粕飼料，利用半固體發(fā)酵的方法，使棉酚含量低于0.01％，但小分子肽含量較低，并且該方法中，黑曲霉菌種接種量為5-15％，芽孢桿菌菌種接種量為20-40％，接種量太大，成本過高。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種利用霉菌制備棉籽肽的方法，將棉籽粕中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子肽，提高蛋白質(zhì)的吸收利用率，同時，脫去了棉籽粕中的棉酚等抗營養(yǎng)物質(zhì)，達到脫酚去毒的功效，提高了棉籽肽的使用安全性。
為了達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種利用霉菌制備棉籽肽的方法，包括以下步驟：
1)制備發(fā)酵底物
將棉籽粕粉碎，過篩，與硫酸銨、氯化鈉混合，加水攪拌均勻；
2)制備發(fā)酵液
斜面培養(yǎng)：將霉菌菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基上，28～30℃下恒溫培養(yǎng)24-48h；
種子液培養(yǎng)：無菌條件下，用生理鹽水沖洗固體斜面培養(yǎng)基，獲得活化的霉菌種子液，并接入到種子液培養(yǎng)基中，接種量為3-6％，得到發(fā)酵液，于28～30℃、轉(zhuǎn)速150-250rpm條件下培養(yǎng)48-72h；
3)液體發(fā)酵
將步驟2)所得的發(fā)酵液與步驟1)所得的發(fā)酵底物充分混合，發(fā)酵液的接種量為3-6％，進行好氧發(fā)酵，得到發(fā)酵棉粕；
4)噴霧干燥
將步驟3)中所得發(fā)酵棉粕進行噴霧干燥，制得棉籽肽。
進一步，步驟1)中，各組分質(zhì)量百分數(shù)為：棉籽粕5-10％，硫酸銨2-8％，氯化鈉0.5-1％，水分85-90％，自然pH值。
優(yōu)選地，步驟2)中所述霉菌菌種為黑曲霉、米曲霉、長柄木霉、孤獨腐質(zhì)霉、繩狀青霉和棘孢曲霉中的一種或幾種。
進一步，當所述霉菌菌種為兩種以上時，制備每種霉菌菌株對應的種子液、發(fā)酵液，在步驟3)中，發(fā)酵液與發(fā)酵底物混合前，先混合不同霉菌菌種的發(fā)酵液。
進一步，步驟2)中所述的霉菌固體斜面培養(yǎng)基為：按重量份，馬鈴薯100-200份，葡萄糖10-20份，瓊脂10-20份，MgSO4 0.2-1.0份，NaCl0.5-1份，F(xiàn)eSO4 0.002-0.05份，K2HPO40.3-1.2份，水1000-1500份，自然pH值，110-130℃滅菌20-30min。
又，步驟2)中，所述的種子液培養(yǎng)基為：按重量份，蛋白胨10-20份，酵母提取物3-8份，NaCl 2-6份，水1000-1500份，自然pH值，110-130℃滅菌20-30min。
優(yōu)選地，步驟3)中，發(fā)酵條件為：溫度28-40℃、自然pH值，通風量0.02-0.35vvm，轉(zhuǎn)速150-250rpm，發(fā)酵時間48-60h。
優(yōu)選地，步驟4)中噴霧干燥溫度為80-120℃。
優(yōu)選地，步驟1)中，棉籽粕粉碎后，過10-60目篩。
本發(fā)明中接種量指接入的種子液體積占接種后培養(yǎng)液總體積的比例。
本發(fā)明以棉籽粕為原料，選擇霉菌菌種，通過液體發(fā)酵，可將棉籽粕中的大分子蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為分子量較小的蛋白肽，有利于機體吸收，本發(fā)明所得棉籽肽產(chǎn)品中小肽含量相比發(fā)酵前提高300％以上。
利用本發(fā)明制備方法，將原料棉籽粕中棉酚含量從0.177％降至0.007％以下，棉酚降解率高，脫毒較徹底，產(chǎn)品質(zhì)量達到并優(yōu)于世界衛(wèi)生組織建議的棉酚相對安全含量(≤0.04％)的要求。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
1)本發(fā)明選擇霉菌菌種，將棉籽粕中的大分子蛋白質(zhì)降解為小分子肽，對棉籽粕中的棉酚進行了大量的降解，獲得的棉籽肽產(chǎn)品中，粗蛋白含量比發(fā)酵前提高了10％以上，小分子肽含量比發(fā)酵前提高了300％以上，利于機體吸收，游離棉酚的降解率達96％以上，棉酚含量降至0.007％以下，降低了毒性，提高了棉籽肽的總體質(zhì)量，縮短生產(chǎn)周期，大大降低生產(chǎn)成本。
2)本發(fā)明霉菌菌株接種量小，發(fā)酵時間縮短，提高了生產(chǎn)效率。
3)本發(fā)明采用噴霧干燥的方法，其干燥速度非常迅速，相比普通低溫干燥，干燥時間減少80％以上，生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)能力大，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1利用霉菌制備棉籽肽的方法，包括以下步驟：
1)制備發(fā)酵底物
將棉籽粕粉碎，過20目篩后與硫酸銨、氯化鈉混合，加水攪拌均勻，按重量比例，原料組分為：棉籽粕7％，硫酸銨2.5％，氯化鈉0.5％，水分90％，自然pH值。
2)制備發(fā)酵液
斜面培養(yǎng)：將黑曲霉菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基上，30℃下恒溫培養(yǎng)48h；其中，所述固體斜面培養(yǎng)基為：馬鈴薯(去皮)150g，葡萄糖15g，瓊脂15g，MgSO4 0.25g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO4 0.02g，K2HPO4 0.5g，將各組分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃滅菌30min。
種子液培養(yǎng)：無菌條件下，用生理鹽水將活化的斜面菌種洗下，并按照接種量4％的比例接入到種子液培養(yǎng)基中，獲得發(fā)酵液，于30℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)48h。
所述種子液培養(yǎng)條件為：蛋白胨12g，酵母提取物6g，NaCl 5g，將上述組分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃滅菌30min。
3)液體發(fā)酵
將步驟2)所得的發(fā)酵液按接種量4％，體積比例，與步驟1)所得的發(fā)酵底物充分混合，于發(fā)酵罐中進行好氧發(fā)酵，發(fā)酵條件為：溫度35℃、自然pH值，通風量0.33vvm，轉(zhuǎn)速200rpm，發(fā)酵時間48h。
4)噴霧干燥
將步驟3)中所得發(fā)酵棉粕于90℃進行噴霧干燥制得棉籽肽。
實施例2利用霉菌制備棉籽肽的方法，包括以下步驟：
1)制備發(fā)酵底物
將棉籽粕粉碎，過20目篩，與硫酸銨、氯化鈉混合，加水攪拌均勻，按重量比例，原料組分為：棉籽粕10％，硫酸銨3％，氯化鈉1％，水分86％，自然pH值。
2)制備發(fā)酵液
斜面培養(yǎng)：將黑曲霉、米曲霉菌株分別接種到固體斜面培養(yǎng)基上，30℃下恒溫培養(yǎng)48h；所述固體斜面培養(yǎng)條件為：馬鈴薯(去皮)180g，葡萄糖13g，瓊脂12g，MgSO4 0.29g，NaCl 0.6g，F(xiàn)eSO4 0.03g，K2HPO4 0.8g，將上述各組分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃滅菌30min。
種子液培養(yǎng)：無菌條件下，用生理鹽水將活化的黑曲霉、米曲霉菌種洗下，并按照各自接種量6％的比例接入到種子液培養(yǎng)基中，分別獲得黑曲霉發(fā)酵液和米曲霉發(fā)酵液，于30℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)48h；
所述種子液培養(yǎng)條件為：蛋白胨14g，酵母提取物7g，NaCl 6g，將上述組分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃滅菌30min。
3)液體發(fā)酵
將步驟2)所得的發(fā)酵液按等體積混合，與步驟1)所得的發(fā)酵底物充分混合，其中，混合發(fā)酵液的接種量為6％，于發(fā)酵罐中進行好氧發(fā)酵，發(fā)酵條件為：溫度35℃、自然pH值，通風量0.33vvm，轉(zhuǎn)速200rpm，發(fā)酵時間60h。
4)噴霧干燥
將步驟3)中所得發(fā)酵棉粕于80℃進行噴霧干燥制得棉籽肽。
實施例3利用霉菌制備棉籽肽的方法，包括以下步驟：
1)制備發(fā)酵底物
將棉籽粕粉碎，過20目篩，與硫酸銨、氯化鈉混合，加水攪拌均勻，按重量比例，原料組分為：棉籽粕8％，硫酸銨2％，氯化鈉1％，水分89％，自然pH值。
2)制備發(fā)酵液
斜面培養(yǎng)：將黑曲霉、米曲霉、長柄木霉菌株分別接種到固體斜面培養(yǎng)基上，30℃下恒溫培養(yǎng)48h；所述固體斜面培養(yǎng)條件為：馬鈴薯(去皮)200g，葡萄糖15g，瓊脂12g，MgSO40.29g，NaCl 0.6g，F(xiàn)eSO4 0.06g，K2HPO4 0.8g，將上述各組分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃滅菌30min；
種子液培養(yǎng)：無菌條件下，用生理鹽水將活化的黑曲霉、米曲霉、長柄木霉菌種洗下，并按照各自接種量5％的比例分別接入到種子液培養(yǎng)基中，獲得黑曲霉發(fā)酵液、米曲霉發(fā)酵液和長柄木霉發(fā)酵液，于30℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)48h。
所述種子液培養(yǎng)條件為：蛋白胨15g，酵母提取物7g，NaCl 7g，將上述組分溶于1000ml水中，自然pH值，121℃滅菌30min；
3)液體發(fā)酵
將步驟2)所得的發(fā)酵液按等體積混合接種量按體積的5％與步驟1)所得的發(fā)酵底物充分混合，于發(fā)酵罐中進行好氧發(fā)酵，發(fā)酵條件為：溫度35℃、自然pH值，通風量0.33vvm，轉(zhuǎn)速200rpm，發(fā)酵時間60h。
4)噴霧干燥
將步驟3)中所得發(fā)酵棉粕于100℃進行噴霧干燥制得棉籽肽。
實施例4檢測棉籽肽中粗蛋白、小肽、游離棉酚含量
對本發(fā)明實施例1-3制備的棉籽肽進行檢測，以未發(fā)酵的棉籽粕作為對比例。
其中，粗蛋白的含量檢測參考國家標準GB/T6432-94。
小肽的含量檢測方法參考輕工業(yè)行業(yè)標準QB/T 2653-2004。
游離棉酚檢測方法參考國家標準GB13086-91。
檢測結(jié)果如表1所示。
表1
由表1可知，與未發(fā)酵的棉籽粕相比，實施例1棉籽粕在發(fā)酵后其粗蛋白含量提高12.83％，小肽提高率為300％，游離棉酚降解率達96.0％，實施例2棉籽粕在發(fā)酵后其粗蛋白含量提高22.07％，小肽提高率為414％，游離棉酚降解率達96.6％，實施例3棉籽粕在發(fā)酵后其粗蛋白含量提高15.99％，小肽提高率為357％，游離棉酚降解率達97.2％。
利用本發(fā)明，可將棉籽粕小肽含量提高300％以上，游離棉酚的降解率達96％以上。