本發(fā)明涉及細(xì)胞生物工程領(lǐng)域，具體為一種骨橋蛋白活化樹突狀細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

全長骨橋蛋白(osteopontin,OPN)作為帶負(fù)電的非膠原性骨基質(zhì)糖蛋白，廣泛的分布于多種組織和細(xì)胞中，其相對分子質(zhì)量約為44kDa，約含300個氨基酸殘基，骨橋蛋白多肽鏈的二級結(jié)構(gòu)中包括8個α螺旋和6個β折疊結(jié)構(gòu)，高度保守的RGD基元兩端各有一個β折疊結(jié)構(gòu)，分子中心部位是a螺旋結(jié)構(gòu)。全長骨橋蛋白中包括凝血酶裂解位點：RGD序列結(jié)構(gòu)中有RS位點，位于RGD序列羧基端第6位氨基酸殘基所形成的肽鍵，是凝血酶的裂解位點，可將其裂解成45kD及24kD兩個片斷。其中45kD片斷更能刺激細(xì)胞的黏附和遷移。

OPN廣泛的分布于多種組織和細(xì)胞中，能夠參與組織修復(fù)，自身代謝等功能。正常情況下其表達(dá)甚微的細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、SMC、T淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等在一些誘導(dǎo)因素下可以大量表達(dá)OPN，包括：(1)高血壓，(2)高血糖，(3)低氧，(4)干擾素，(5)成纖維細(xì)胞生長因子，(6)其他因素。

OPN可表達(dá)于各種組織里，不同細(xì)胞類型也能表達(dá)OPN，如骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞(SMC)、活化的T細(xì)胞、MФ和自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞亞群；OPN也存在正常體液里，如血清、乳汁、尿液，膽汁。病理狀態(tài)(免疫性疾病、炎癥和腫瘤)OPN表達(dá)增強，如大腸癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、皮膚癌及各種轉(zhuǎn)化細(xì)胞系亦能高水平表達(dá)OPN。

外周血單個核細(xì)胞，PBMC(peripheral blood mononuclear cell)，指外周血中具有單個核的細(xì)胞，包含淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和其它少量細(xì)胞(造血干細(xì)胞等)。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名，是機體功能最強的專職抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cells,APC)，它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，未成熟樹突狀細(xì)胞具有較強的遷移能力，成熟樹突狀細(xì)胞能有效激活初始型T細(xì)胞，處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。

樹突狀細(xì)胞自身具有免疫刺激能力，是目前發(fā)現(xiàn)的惟一能激活未致敏的初始型T細(xì)胞的APC。人體內(nèi)大部分樹突狀細(xì)胞處于非成熟狀態(tài)，表達(dá)低水平的共刺激因子和粘附因子，體外激發(fā)同種混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的能力較低，但未成熟樹突狀細(xì)胞具有極強的抗原吞噬能力，在攝取抗原(包括體外加工)或受到某些因素刺激時即分化為成熟樹突狀細(xì)胞，而成熟的樹突狀細(xì)胞表達(dá)高水平的共刺激因子和粘附因子。樹突狀細(xì)胞在成熟的過程中，由接觸抗原的外周組織遷移進(jìn)入次級淋巴器官，與T細(xì)胞接觸并激發(fā)免疫應(yīng)答。

T細(xì)胞的有效活化需要兩個信號的參與，即需要抗原肽-MHC復(fù)合物與TCR-CD 3結(jié)合提供第1信號，以及共刺激分子介導(dǎo)的第2信號。最基本的共刺激信號由抗原遞呈細(xì)胞表達(dá)的CD80、CD86分子與T細(xì)胞上表達(dá)的相應(yīng)受體提供。

樹突狀細(xì)胞作為目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的APC，能夠誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)生成。近年來研究表明,應(yīng)用腫瘤相關(guān)抗原或抗原多肽體外沖擊致敏樹突狀細(xì)胞，回輸或免疫接種于載瘤宿主，可誘發(fā)特異性CTL的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

樹突狀細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，大部分實體瘤內(nèi)浸潤的樹突狀細(xì)胞數(shù)量多則患者預(yù)后好。有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)的核心是產(chǎn)生以CD8⁺T細(xì)胞為主體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，CD8⁺T細(xì)胞的活化需要樹突狀細(xì)胞遞呈抗原的過程，此過程中CD80、CD86等共刺激分子發(fā)揮了重要作用，這也是樹突狀細(xì)胞作為免疫治療手段的基礎(chǔ)。

樹突狀細(xì)胞在成熟的過程中，由接觸抗原的外周組織遷移進(jìn)入次級淋巴器官，與T細(xì)胞接觸并激發(fā)免疫應(yīng)答。樹突狀細(xì)胞作為目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的APC，能夠誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)生成。近年來研究表明，應(yīng)用腫瘤相關(guān)抗原或抗原多肽體外沖擊活化樹突狀細(xì)胞，回輸或免疫接種于載瘤宿主，可誘發(fā)特異性CTL的抗腫瘤免疫反應(yīng)。其抗腫瘤的機制如下：①樹突狀細(xì)胞可以高表達(dá)MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子，MHC分子與其捕獲加工的腫瘤抗原結(jié)合，形成肽-MHC分子復(fù)合物，并遞呈給T細(xì)胞，從而啟動MHC-I類限制性CTL反應(yīng)和MHC-Ⅱ類限制性的CD4+Thl反應(yīng)。同時，樹突狀細(xì)胞還通過其高表達(dá)的共刺激分子(CD80/、CD86/、CD40等)提供T細(xì)胞活化所必須的第二信號，啟動了免疫應(yīng)答。②樹突狀細(xì)胞與T細(xì)胞結(jié)合可大量分泌IL-12、IL-18激活T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)CTL生成，主導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，利于腫瘤清除；激活穿孔素P顆粒酶B和FasL/Fas介導(dǎo)的途徑增強NK細(xì)胞毒作用；③樹突狀細(xì)胞分泌趨化因子(Chemotactic Cytokines，CCK)專一趨化初始型T細(xì)胞促進(jìn)T細(xì)胞聚集，增強了T細(xì)胞的激發(fā)。保持效應(yīng)T細(xì)胞在腫瘤部位長期存在，可能通過釋放某些抗血管生成物質(zhì)(如IL-12、IFN-γ)及前血管生成因子而影響腫瘤血管的形成。上述CCK進(jìn)一步以正反饋旁分泌的方式活化樹突狀細(xì)胞，上調(diào)IL-12及CD80、CD86的表達(dá)；同時樹突狀細(xì)胞也直接向CD8+T細(xì)胞呈遞抗原肽，在活化的CD4+T細(xì)胞輔助下使CD8+T細(xì)胞活化，CD4+和CD8+T細(xì)胞還可以進(jìn)一步通過分泌細(xì)胞因子或直接殺傷，增強機體抗腫瘤免疫應(yīng)答。

流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry,FCM)是利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞等生物粒子的理、化及生物學(xué)特性進(jìn)行分析的方法。它集中了單克隆抗體技術(shù)、激光技術(shù)、計算機技術(shù)、細(xì)胞化學(xué)和免疫化學(xué)技術(shù)。利用流式細(xì)胞儀可以對細(xì)胞等生物粒子的理化及生物學(xué)特性(細(xì)胞大小、DNA含量、細(xì)胞表面抗原表達(dá)等)進(jìn)行定量、快速、客觀、多參數(shù)相關(guān)的檢測。流式細(xì)胞儀的基本原理是采用流體動力學(xué)聚焦以保證細(xì)胞按同一方式逐一通過激光束(檢測區(qū))。當(dāng)樣本流中的細(xì)胞經(jīng)過流動室中的檢測區(qū)時，橢圓形的激光束即可檢測到細(xì)胞信號。包括細(xì)胞的散射光以及細(xì)胞上標(biāo)有的熒光染料發(fā)出的激光。

T細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞細(xì)胞是腫瘤免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞，是宿主抵抗腫瘤細(xì)胞生長的第一道防線。機體正常的免疫機制有賴于輔助性T細(xì)胞與抑制性T細(xì)胞比值的協(xié)調(diào)，故樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及其亞群能夠直接反映機體細(xì)胞免疫的狀態(tài)。

活化血液中樹突狀細(xì)胞非常重要：首先樹突狀細(xì)胞功能的強弱與機體免疫功能密切相關(guān)，發(fā)病初期如果樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞活化功能較弱，可預(yù)測患者可能預(yù)后不佳，腫瘤侵襲度高；其次，腫瘤、感染等疾病患者樹突狀細(xì)胞功能降低，樹突狀細(xì)胞功能的強弱與疾病的預(yù)后密切相關(guān)。

現(xiàn)有技術(shù)中，尚不能有效體外活化樹突狀細(xì)胞，而達(dá)到增強免疫，增加抗腫瘤作用的目的。因此現(xiàn)急需發(fā)明一種活化樹突狀細(xì)胞的方法以解決活化T細(xì)胞、抗腫瘤的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種采用骨橋蛋白體外活化血液中樹突狀細(xì)胞的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種全長骨橋蛋白體外活化樹突狀細(xì)胞的方法：在外周血單個核細(xì)胞(PBMC)懸液中加入濃度為5g/ml的全長骨橋蛋白(OPN)稀釋液，放入37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48±2小時，從而實現(xiàn)對外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中的樹突狀細(xì)胞(DC)的活化；

所述外周血單個核細(xì)胞(PBMC)懸液與全長骨橋蛋白(OPN)稀釋液的用量比為：1ml/(50±5)ul。

作為本發(fā)明的全長骨橋蛋白體外活化樹突狀細(xì)胞的方法的改進(jìn)：外周血單個核細(xì)胞(PBMC)懸液的制備方法為：

將PBMC用改進(jìn)型RPMI 1640培養(yǎng)液(即，含10％FBS、100IU/L青霉素、100g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液)稀釋成1×10⁶/L～2×10⁷/L，然后于37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48±2小時；

上述改進(jìn)型RPMI 1640培養(yǎng)液(即，含10％FBS、100IU/L青霉素、100g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液)的配制方法為：取常規(guī)的RPMI 1640培養(yǎng)基1000ml，加入0.1L的FBS(胎牛血清)、100IU青霉素、100g鏈霉素，均勻混合。

在本發(fā)明中，全長骨橋蛋白(OPN)稀釋液采用PBS緩沖液(pH7.2～7.4)進(jìn)行稀釋。

本發(fā)明利用OPN活化外周血PBMC中樹突狀細(xì)胞的檢測方法，可按照以下步驟進(jìn)行：

(1)從大腸癌患者外周血全血中分離出外周血單個核細(xì)胞，即PBMC；

(2)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測PBMC中DC細(xì)胞的表達(dá)量；

(3)在健康成年人中，當(dāng)CD80、CD86占PBMC中DC的比例分別為(8.5±1.01)％和(34.4±1.08)％(是指P<0.05，該數(shù)值有統(tǒng)計學(xué)意義)，表示外周血單個核細(xì)胞中DC細(xì)胞的活性處于正常范圍；同時，在大腸癌患者中，當(dāng)CD80、CD86占PBMC中DC的比例分別低于(8.5±1.01)％和(34.4±1.08)％時，表示外周血單個核細(xì)胞中DC細(xì)胞處于免疫抑制狀態(tài)，樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的抗腫瘤功能受到了抑制。采用本發(fā)明方法OPN刺激后大腸癌患者、健康成人的PBMC中，CD80、CD86占PBMC中DC的比例分別升高，表示外周血單個核細(xì)胞中DC被OPN活化，抗大腸癌活性更強。

本發(fā)明通過檢測外周血液內(nèi)DC的表達(dá)量來指示患者DC抗大腸癌活性的能力，能夠更直觀精準(zhǔn)地提示患者DC的活性，進(jìn)而更明確的說明在是否有OPN刺激時，DC細(xì)胞抗腫瘤細(xì)胞的活性的不同強度。

本發(fā)明方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，易于分析，適用于同一細(xì)胞群多參數(shù)同時測定。減少了間接標(biāo)記法中較強的非特異熒光的干擾，因此更適用于臨床標(biāo)本的檢測。

綜上所述，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白可以體外誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的活化，在OPN干預(yù)過程中，患者DC細(xì)胞表面活化標(biāo)志物的增加表明OPN可以活化DC細(xì)胞，以達(dá)到增加抗腫瘤的作用的效果。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1為流式細(xì)胞儀檢測，健康成年人未經(jīng)或經(jīng)OPN活化的外周血分離的DC細(xì)胞中CD80、CD86以及大腸癌患者DC細(xì)胞上CD80、CD86的表達(dá)水平圖；

圖1中，HC代表健康成年人，對照組為加入BSA，活化組為添加OPN。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。

圖像處理軟件：Image Pro Plus6.0。

統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件分析，各樣本均數(shù)的比較采用Student t test分析。

全血樣本來自于浙江大學(xué)第一醫(yī)院肝膽外科大腸癌患者血液樣本，以及浙大一院檢驗科的健康成年人的血液樣本。CD80及CD86、BDCA1等單抗購自美國BD公司以及美國Biolegend公司，流式細(xì)胞儀為美國貝克曼庫爾特有限公司(Beckman Coulter,Inc.)的cantoII型號。離心管和離心機購自Thermo公司，淋巴細(xì)胞分離液，購自天津市TBD生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，淋巴細(xì)胞凍存液等生化試劑均購自上海盛兆生物科技有限公司及上海達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。熒光顯微鏡購自O(shè)lympus。

實施例1：

在OPN(全長骨橋蛋白)的刺激下，一種通過流式細(xì)胞儀檢測CD80、CD86表達(dá)量來評估DC細(xì)胞(樹突狀細(xì)胞)在健康成年人中OPN是否可以活化樹突狀細(xì)胞，包括以下步驟：

(1)從健康成年人外周血全血中分離出外周血單個核細(xì)胞PBMC；

該步驟具體包括：該步驟具體包括：

A、健康成年人血的收集：

由浙一醫(yī)院國際健康保健中心提供健康體檢人體的外周血全血58例。

B、健康成年人PBMC的分離：

將收集到的全血樣本，置于離心機中3000rpm離心5分鐘。吸出血漿后，將剩余血細(xì)胞液加入到已放入等體積PBS的15毫升離心管中充分混勻。將混勻后的液體沿離心管壁緩慢加入到已放入與PBS緩沖液(pH7.2～7.4)等體積的人淋巴細(xì)胞分離液(例如為天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)的貨號LTS1077N)，注意不要與人淋巴細(xì)胞分離液混合。上述操作完成后，將離心管置入離心機2000rpm離心20分鐘(備注說明：離心后會形成由上至下細(xì)胞分四層。第一層為胎牛血清液層。第二層；為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞。第三層；為透明分離液層。第四層；為紅細(xì)胞層)，收集第二層細(xì)胞放入PBS4～5毫升的試管中，充分混勻后，以1500-2000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。沉淀經(jīng)反復(fù)洗2次即得所需細(xì)胞。

(2)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測DC細(xì)胞中CD80，CD86的表達(dá)量：

該步驟具體包括：

A、細(xì)胞膜上免疫熒光直接標(biāo)記法：將收集的PBMC用改進(jìn)型RPMI 1640培養(yǎng)液(即，含10％FBS、100IU/L青霉素、100g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液)稀釋成2×10⁷/L，細(xì)胞懸液分別加入48孔板中，每孔500ul體積，每孔細(xì)胞數(shù)為1*10⁴個/well，在37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時；得PBMC懸液；

①、對照組；BSA刺激48小時組；即，在1ml健康成年人PBMC懸液中加入50ul BSA稀釋液(BSA濃度為5g/ml)進(jìn)行刺激(為OPN刺激對照)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37℃、5％CO₂培養(yǎng)48小時后收集細(xì)胞；

②、OPN(骨橋蛋白)刺激48小時組；即，在1ml健康成年人PBMC懸液中加入50ul OPN稀釋液(OPN濃度為5g/ml)進(jìn)行刺激，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37℃、5％CO₂培養(yǎng)48小時后收集細(xì)胞。

上述BSA稀釋液、OPN稀釋液均采用PBS緩沖液(pH7.2～7.4)進(jìn)行稀釋。

B、上述溫箱中孵育48h后，配成PBMC濃度為2×10⁷/ml的細(xì)胞懸液(可采用改進(jìn)型RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行濃度的調(diào)節(jié))，取1ml的細(xì)胞懸液離心后去培養(yǎng)上清，將細(xì)胞打散后，用PBS(pH7.2～7.4)洗一遍，后將細(xì)胞打散，加入流式細(xì)胞儀專用的鞘液(例如為Beckman coulter公司生產(chǎn)的8546733型號/貨號)100μl重懸，混勻于室溫中靜置1分鐘以上，再直接加入連接有熒光素的抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記反應(yīng)，做多標(biāo)染色，把幾種標(biāo)記有不同熒光素的抗體同時加入。標(biāo)記有不同熒光素的抗體具體為BDCA1(PE)、CD80(V450)、CD86(FITC)，用量分別為5ug、10ug、5ug。

C、流式細(xì)胞儀上觀察細(xì)胞分子標(biāo)記物CD80,CD86占PBMC的百分比，分析流式圖，處理數(shù)據(jù)。

(3)健康成年人對照組，細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測后，CD80,CD86細(xì)胞占DC細(xì)胞的比例范圍在(8.5±1.01)％和(12.8±1.08)％(指P<0.05，該數(shù)值有統(tǒng)計學(xué)意義)時，表示外周血單個核細(xì)胞中的DC細(xì)胞的CD80,CD86表達(dá)量處于正常范圍；OPN刺激48小時后，CD80,CD86占外周血單個核細(xì)胞PBMC中DC細(xì)胞的比例高于(8.5±1.01)％和(12.8±1.08)％，該比例分別為(34.56±1.20)％和(30.75.±1.40)％(指P<0.05，該數(shù)值有統(tǒng)計學(xué)意義)時，表示外周血單個核細(xì)胞中DC細(xì)胞的活性被激活或者增強。

實施例2：

一種通過流式細(xì)胞儀檢測CD80、CD86表達(dá)量來評估OPN是否能活化DC增強抗癌活性的方法：

將實施例1步驟(1)中的“健康成年人的外周血全血”改成“大腸癌患者外周血全血”，即，從從大腸癌患者外周血中(患者已通過年齡，癥狀，病理切片金標(biāo)準(zhǔn)，影像學(xué)診斷等指標(biāo)及根據(jù)臨床表現(xiàn)評估的TNM分期的評分明確診斷患有大腸腫瘤)全血分離出外周血單個核細(xì)胞PBMC；

其余等同于實施例1。

所得結(jié)果如下：

健康成人中DC細(xì)胞的CD80、CD86的表達(dá)量的正常范圍為(8.5±1.01)％和(12.8±1.08)％，大腸癌患者的DC細(xì)胞中的CD80、CD86的表達(dá)量低于正常范圍，分別為(6.95±1.22)％和(8.09±1.28)％(是指P<0.05，該數(shù)值有統(tǒng)計學(xué)意義)。說明大腸癌患者有免疫功能的缺陷，DC細(xì)胞上的CD80,CD86低于正常范圍，存在功能缺陷；經(jīng)過OPN刺激后的大腸癌患者與未經(jīng)刺激的大腸癌患者相比較，CD80、CD86占外周血的DC細(xì)胞的比例高于(6.95±1.22)％和(8.09±1.28)％(是指P<0.05，該數(shù)值有統(tǒng)計學(xué)意義)時，分別為(19.67±1.14)％和(14.58±0,98)％，表示經(jīng)過OPN刺激后大腸癌患者的DC功能得到恢復(fù)和提高，可以進(jìn)一步誘發(fā)抗大腸癌的活性的激活或者增強。

該案例中據(jù)以判斷的數(shù)據(jù)來源是：從2014年10月到2015年12月共收集肝膽外科患者共58例，兩組群體年齡呈正態(tài)分布，實驗比較，組間特異性指標(biāo)后歸納總結(jié)得出大腸癌患者的CD80.CD86的表達(dá)量是低于正常范圍均值的(8,5±1.01)％和(12.8±1.08)％(是指P<0.05，該數(shù)值有統(tǒng)計學(xué)意義)，而用OPN刺激后的大腸癌患者的DC細(xì)胞上CD80、CD86的表達(dá)量是高于正常范圍均值的。被視為DC細(xì)胞的抗大腸癌活性被激活，抗大腸癌活性增強。健康成年人的DC細(xì)胞上的CD80、CD86的表達(dá)量也在正常范圍內(nèi)。

應(yīng)用實施1：

采用實施例1的操作步驟，收集浙大一院國際體檢中心的健康體檢者20例。經(jīng)檢測，健康成年人患者的外周血單個核細(xì)胞的DC細(xì)胞中CD80,CD86表達(dá)量的均值為(7.49±0.96)％和(10.27±1.28)％，其數(shù)據(jù)顯著低于OPN活化后健康成年人的DC細(xì)胞中CD80、CD86的表達(dá)量的均值(34.56±1.20)％和(30.75.±1.40)％這一數(shù)據(jù)。

基于該分析結(jié)論，可以對OPN是否可以活化健康成年人的DC細(xì)胞加以判斷，為后續(xù)OPN能否活化DC細(xì)胞提供量化依據(jù)。

應(yīng)用實施2：

該實施例采用具體實施例2的操作步驟，收集浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽外科就診大腸癌患者(未經(jīng)任何治療后)20例全血樣本以及浙大一院國際體檢中心的健康體檢者20例血液樣本。經(jīng)檢測，藥物治療前的大腸癌患者的外周血單個核細(xì)胞的DC細(xì)胞中CD80、CD86表達(dá)量均值分別為分別為(6.95±1.22)％和(8.09±1.28)％，其數(shù)據(jù)低于健康成年人的DC細(xì)胞中的CD80、CD86的表達(dá)量均值的正常范圍，但經(jīng)過OPN刺激后，大腸癌患者的PBMC中DC細(xì)胞中CD80,CD86的表達(dá)量分別為(19.67±1.14)％和(14.58±0,98)％，比例明顯高于未應(yīng)用OPN刺激的大腸癌患者的血樣。

被視為DC細(xì)胞的抗大腸癌活性被激活，抗大腸癌活性增強。但與健康成年人相比，大腸癌患者被OPN激活的活性不如健康成年人強，健康成年人被激活后，PBMC中DC細(xì)胞比例分別為(34.56±1.20)％和(30.75.±1.40)％(指P<0.05，該數(shù)值有統(tǒng)計學(xué)意義)。所以應(yīng)用健康成年人被OPN激活的DC細(xì)胞抗腫瘤的效果更加明顯有效。

基于上述分析結(jié)論，本發(fā)明根據(jù)健康成年人以及大腸癌患者的PBMC，檢測健康成年人的DC是否可以被OPN刺激后，活化，通過流式細(xì)胞儀檢測DC(BDCA1標(biāo)記)細(xì)胞上的分子標(biāo)記物CD80、CD86；如可以活化，則可以通過異體移植健康成年人的DC細(xì)胞到腫瘤病人血液內(nèi)，以此來對抗腫瘤病人的DC細(xì)胞的免疫缺陷，來對抗腫瘤的增值和生長轉(zhuǎn)移，為腫瘤的進(jìn)一步治療提供一種方法。

對比例1、將實施例1和實施例2中的全長骨橋蛋白(OPN)稀釋液的用量由“50ul”改成“30ul”，其余等同，所得結(jié)果為：該用量的OPN刺激48小時后，CD80、CD86占外周血單個核細(xì)胞PBMC中DC細(xì)胞的比例仍然為(8.5±1.01)％和(12.8±1.08)％，表示外周血單個核細(xì)胞中DC細(xì)胞的沒有被活化。

該用量的OPN刺激后的大腸癌患者的DC細(xì)胞上CD80、CD86的表達(dá)量是仍然為(6.95±1.22)％和(8.09±1.28)％，表示大腸癌患者外周血單個核細(xì)胞中DC細(xì)胞的沒有被活化。

對比例2、將實施例1和實施例2中的全長骨橋蛋白(OPN)稀釋液的用量由“50ul”改成“80ul”，其余等同，所得結(jié)果為：該用量的OPN刺激48小時后，CD80、CD86占外周血單個核細(xì)胞PBMC中DC細(xì)胞的比例分別為(34.56±1.20)％和(30.75.±1.40)％(指P<0.05，該數(shù)值有統(tǒng)計學(xué)意義)，與“50ul”的用量下的OPN刺激濃度使DC細(xì)胞升高的比例基本相同，說明本發(fā)明是最適濃度，隨著濃度的增加，DC升高比例保持不變，只會浪費蛋白試劑。

該用量的OPN刺激48小時后，大腸癌患者DC上的CD80、CD86并沒有明顯的升高，保持在(19.67±1.14)％和(14.58±0,98)％說明本發(fā)明的OPN刺激是最適濃度。加多蛋白的刺激只會浪費試劑。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。